清金得生片对人肺腺癌细胞端粒酶及凋亡相关基因蛋白表达的影响

清金得生片对人肺腺癌细胞端粒酶及凋亡相关基因蛋白达的影响 清金得生片对人肺腺癌细胞端粒酶及凋亡 相关基因蛋白表达的影响 中药新药与临床药理2007年5月第18卷第3期?203? 清金得生片对人肺腺癌细胞端粒酶及凋亡相关基因蛋白表达的影响 陈林香,周岱翰,陈雪馨,陈瑶(广州中医药大学第一临床医学院肿瘤研究所,广州510405) 摘要:目的探讨清金得生片抑制肺癌细胞生长的相关分子机制.方法采用免疫组织化学染色(SABC)方法检测清 金得生片含药血清处理后人肺腺癌细胞株端粒酶活性和凋亡相关基因bcl一2,bax的表达水平.结果清金得生片 含药血清作用72h,人肺腺癌细胞端粒酶活性明显抑制,同时可下调bcl一2蛋白阳性细胞染色率,上调bax蛋白阳 性细胞染色率.结论清金得生片通过抑制人肺腺癌细胞端粒酶活性,调节bcl一2和bax蛋白的表达,发挥抗肿瘤 作用. 关键词:清金得生片;人肺腺癌细胞株;端粒酶;bcl一2;bax;免疫组化 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1003—9783(2007)03—0203—03 EffectsofQingfinDeshengTabletsonTelomeraseandProteinExpressionsofApoptosisRel evantGenesinHu- manLungAdenocarcinomaCells CHENLinxiang,ZHOUDaihan,CHENXuexin,CHENYao(TumorInstituteoftheFirstAffi liatedHospital,Guangzhou UniversityofTCM,Guangzhou510405) Abstract-ObjectiveToexplorethemolecularmechanismofQingjinDeshengTabletsoninhi bitingthegrowthoflung cancercellsandtosupplyexperimentalevidencesforChineseherbalmedicinepreventingan dcuringlungcancerinclini— calapplication.MethodsImmunohistochemistrystainingwasusedtodetecttheactivityoftel omeraseandtheexpression ofbcl一2andbaxinhumanlungadenocarcinomacellsaftertreatedwithserumcontainingQingjinDe shengTablets.Re- suitsTheactivityoftelomerasewasinhibitedsignificantlyandthepositiverateofbcl一2proteinreduced,andtheposi— tiverateofbax2increasedinhumanlungadenocarcinomacellsafter72hour—treatmentwiththeserumcontaining QingjinDeshengTablets.ConlusionQingfinDeshengTabletsexerttheanti—tumoractionthroughinhibitingtheactivi— tyoftelomeraceandmodulatingtheexpressionofbcl一2andbaxprotein. Keywords:QingjinDeshengTablets;Humanlungadenocarcinomacells;Telomerase;Bcl 一2;Bax;Immunohisto— chemistry 清金得生片由西洋参,绞股蓝,麦冬,黄柏,蟾 蜍,山慈菇等药组成,具有清肺解毒,扶正消瘤的功 效,主治原发性肺癌及转移性肺癌.研究证实,清金 得生片能明显抑制小鼠Lewis肺癌及人肺腺癌(LAC) 细胞株生长,诱导细胞凋亡,提高荷瘤小鼠的免疫功 能,延长生存期?】.本研究采用免疫组化染色 (SABC)方法从抑制端粒酶活性,调节bcl一2及bax 蛋白表达水平,探讨清金得生片抗肺癌的分子机制. 1与方法 1.1动物与细胞株Wistar大鼠,体重220,250g, 雌雄各半,由广州中医药大学实验动物中心提供.人 肺腺癌细胞株由广州军区总医院分子肿瘤学研究所提 供,我所移植传代. 收稿日期:2006—12—05 作者简介:陈林香(1951一),女,副研究员,主要从事肿瘤基础研究. 基金项目:广东省中医药管理局资助(编号1040027). 1.2药物清金得生片,每片含生药0.3g,广州中 医药大学第一附属医院制剂室提供,实验时用蒸馏水 配成所需浓度;替加氟片(FT一207),济南制药厂产 品,批号:20010505. 1.3试剂与仪器端粒酶,bcl一2及bax免疫组化染 色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司).COz培养 箱(美国).低温冰箱(中国海尔). 1.4实验方法 1.4.1血清的制备取Wistar大鼠l5只,随机分为 3组,清金得生片组9只,FT一207片组和阴性对照 组各3只.清金得生片组,8g/kg(所用剂量均为生 药量)灌胃,FT一207片组,0.2g/kg灌胃,阴性对照 组灌胃同体积的生理盐水,每天给药2次,连续3d, ? 204?TraditionalChineseDrugResearch&Clinica1Pharmaco]ogv,2007May,Vo1.18 No.3 末次给药前禁食不禁水12h,末次给药2h后,以相 同剂量重复给药1次,1h后乙醚麻醉,75%乙醇消 毒,无菌条件下心脏取血,无菌分离血清即为含药血 清,置一20?冰箱保存备用.临用前用RPMI一 1640培养液调成所需浓度供实验用. 1.4.2人肺腺癌细胞培养与处理将冻存的人肺腺癌 细胞(LAC)按常规方法复苏,经传3代的肺腺癌细胞 按2×105/mL密度,分别接种于含10%小牛血清的 RPMI一1640培养液的6个培养瓶中,于37.【=,5% COz培养箱中培养24h至细胞贴壁,吸弃旧培养 液,分别加入10%,20%,30%浓度的清金得生片 含药血清RPMI一1640培养液5mL,另设阳性对照 (20%FT一207片含药血清1640培养液),阴性对照 (20%大鼠血清1640培养液),空白对照(20%小牛 血清1640培养液),继续培养72h,人肺腺癌细胞经 0.25%胰蛋白酶消化PBS洗2次,离心去上清2,5 min,每组涂片6张. 1.4.3免疫组化法检测人肺腺癌细胞端粒酶,bcl一2 及bax的表达细胞涂片,采用SABC法染色,方法按 试剂盒说明书步骤进行.端粒酶,bcl一2及bax单抗 (1:150稀释),以PBS液代替一抗作阴性对照. 1.4.4结果判断端粒酶,bcl一2及bax免疫阳性 产物位于肿瘤细胞浆,呈棕黄色颗粒,部分呈弥散 状.随机观察计数200个肿瘤细胞,并求出阳性细 胞百分率. 1.4.5统计学方法应用SPSS11.0统计软件,采用 t检验 2结果 2.1对人肺腺癌细胞端粒酶活性的影响清金得生片 含药血清培养液作用72h,人肺腺癌细胞端粒酶阳性 细胞染色率下降,并呈明显的量效关系,与空白对照 组比较有显着性差异(P<0.01);与阴性对照组比 较,20%,30%浓度的清金得生片含药血清组有显 着性差异(P<0.05),结果见表1. 2.2对人肺腺癌细胞bcl一2及bax基因表达的影响 清金得生片含药血清培养液作用72h,人肺腺癌细胞 bcl一2阳性细胞染色率均下降,并有一定的量效关 系;人肺腺癌细胞bax阳性细胞染色率呈浓度依赖性 上升,含药血清20%,30%浓度组与阴性,空白对 照组均有显着性差异(P<0.01),结果见表2. 3讨论 肿瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞的增殖有关,与 表1清金得生片含药血清对人肺腺癌细 胞端粒酶活性的影响(面?s,n=6) 注:与空白对照组比较,"P<0.0l,P<0.001;与阴性对 照组比较,P<0.05. 表2清金得生片含药血清对人肺腺癌细胞 bcl一2及bax蛋白表达的影响(面?s.n=6) 注:与空白对照组比较,P<0.05,"P<0.0l;与阴性对照组 比较,P<0.05,"P<0.01,"P<0.001. 细胞凋亡及端粒酶活性也密切相关.端粒酶被认为是 特异的肿瘤标记物】,在肿瘤诊断和治疗方面具有良 好前景.端粒酶是一种以自身RNA为,逆转录 合成端粒末端串联重复序列TFAGGG的核糖核蛋 白,具有维持端粒末端的功能,其激活与恶性肿瘤的 形成和发展密切相关?.大量研究证实端粒酶在大多 数肿瘤细胞中异常活化,从而使瘤细胞获得异常增殖 的能力,即永生化.本研究中,端粒酶活性检测结 果显示,清金得生片含药血清各剂量组阳性细胞染色 率与阴性对照组比较有显着性差异,提示清金得生片 含药血清对端粒酶活性有明显的抑制作用. 目前研究表明16],许多与凋亡相关的基因参与细 胞凋亡及细胞增殖的调控.清金得生片含药血清作用 72h,人肺腺癌细胞bcl一2阳性细胞染色率下降, bax阳性细胞染色率上升,呈明显的量效关系,提示 清金得生片能使抗凋亡基因bcl一2的表达下降,促 进凋亡基因bax的表达增加.我们认为清金得生片可 能是通过抑制端粒酶活性,调节肿瘤细胞增殖与凋亡 过程的相关基因蛋白,特别是阻断抗凋亡基因bcl一2 的作用,促进凋亡基因bax的作用,使肺腺癌细胞的 凋亡明显增加,异常增殖的肺癌细胞得到控制. 中药新药与临床药理2007年5月第18卷第3期?205? 参考文献: [1]戴馨仪,陈林香,周岱翰,等.清金得生片抗肿瘤机理研究[J]. 中药新药与临床药理,2002,16(6):360. [2]陈林香,戴馨仪,周岱翰,等.清金得生片对小鼠移植性肝癌细 胞增生与凋亡的影响[J].肿瘤研究与临床试验,2003,15(3): 1S3. 【3]FengJ,FunkWD,WangSS,eta1.TheRNAcomponentofhuantelom— erase[J].Science,1995,269(5228):123. ' /\ 【4]HoltSE,ShayJW.Roleoftelomeraseincellularprolifeationandcancer [J].JCellPhysiol,1999,180(1):10. [5】朱虹光,宋宜.端粒酶的研究进展,存在问及其在病理学中的 应用[J].中华病理学杂志,2000,29(1):57. [6]李登举,张瑶珍,何善述,等.端粒酶与细胞周期,细胞凋亡及癌 基因的关系[J].国外医学?分子生物学分册,2001,23(2):86. (编辑:宋威) 味和中散对胃肠动力及胃肠激素的影响 黄学宽,任凌燕,李进',韩志刚'(1.重庆医科大学中医药学院,重庆400050;2.重庆科技学院生物系,重庆 401331) 摘要:目的观察六味和中散对胃肠动力,胃肠激素的影响及其可能作用机制.方法以香砂六君丸为对照组,观 察不同剂量六味和中散对小鼠小肠推进比,胃内残留率,全胃肠道推进运动时间的 影响;选用200%大黄浓煎剂复 制大鼠脾虚模型,采用放射免疫法检测不同剂量六味和中散对脾虚大鼠胃泌素 (GAS),胃动素(MTL),血管活性肠 肽(VIP)等胃肠激素的影响.结果六味和中散各剂量组与空白对照组比较,有明显 提高小鼠小肠推进比,减少胃内 残留率,缩短全胃肠道推进运动时间的作用(P<0.05或P<0.01),其中以六味和 中散高剂量组更为明显(P< 0.01);与香砂六君丸组比较,六味和中散各剂量组在缩短小鼠全胃肠道推进运动 时间方面具有显着性差异(P< 0.01).而六味和中散各组与脾虚模型组比较,有提高脾虚大鼠GAS,MTL及降低 VIP的作用(P<0.01),其中 六味和中散高剂量组更明显(P<0.01).结论六味和中散具有促进小鼠胃肠动力, 调节脾虚大鼠胃肠激素紊乱 的作用. 关键词:六味和中散;胃肠动力;胃肠激素 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1003—9783(2007)03—0205—03 EffectsofLiuweiHezhongPowderontheGastrOintestinalMotilityandHormones HUANGXuekuan',RENLingyan,LIJin',HANZhigang'(1.CollegeofTCM,ChongqingMedicalUniversity, Chongqing400050;2.Biologydepartment,ChongqingUniversityofScienceandTechnology,Chongqing401331) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofLiuweiHezhongPowderongastrointestinalmotilityandhormones,and toexploreitspossiblemechanism.MethodsThesmallintestinalpropulsionratio,endogastricresidualrateandtotalgas— trointestinalpropulsiontimeinmicewereobservedafterintragastricadministrationofLiuweiHezhongPowder.Radioim— munoassaywasappliedtodetectthechangesofgastrin,motilinandvasoactiveintestinalpolypeptideinspleenasthenia rats.ResultsComparedwiththeblankcontrolgroup,LiuweiHezhongPowdercansignificant lyimprovethesmallintesti— nalpropulsion,reduceendogastricresidueandshortentotalgastrointestinalpropulsiontime(P<0.01,orP<0.05), whichwassimilartothatofXiangshaLiujunPillgroup(P>0.05),butthehighdosagegroupofLiuweiHezhongPowder wereespeciallyremarkable(P<0.01).ComparedwithXiangshaLiujunPillgroup,LiuweiHezhongPowdercansignifi— candyshortenthetotalgastrointestinalpropulsiontime(P<0.01).Comparedwiththeratmodelgroupofspleenastheni一 收稿日期:2007—01—26 作者简介:黄学宽(1972一),男,讲师,硕士.主要从事中医理论研究及临床工 作.Email:xkhuang2002@yahoo.com.cn. 基金项目:重庆市卫生局科研资助项目(2004一B一42).