激动剂引起的_1_肾上腺素受体下调及其部分机制

激动剂引起的_1_肾上腺素受体下调及其部分机制 ( ) 中 国 科 学C 辑 ( )SCI ENCE IN CHINA Series C 第 28 卷 第 4 期1998 年 8 月 α激动剂引起的 2肾上腺素受体下调 1 3 及其部分机制 3 3 许开明田斌张幼怡韩启德 ( ) 北京医科大学第三医院血管医学研究所 ,北京 100083 (α α) 摘要用 仓 鼠 全 长 2肾 上 腺 素 受 体 2A R cDNA 转 染 人 胚 胎 肾 细 胞 1B1B ( ) α( )H E K293得到高效稳定达2A R 的细胞系 ,在此细胞上观察去甲肾上腺素 N E 1B α持续刺激该细胞对2A R 表达的影响. 用 放 射 配 基 结 合 分 析 测 定 受 体 数 量 , 用 1B μRNA 酶保护测定 mRNA 水平. 结果显示细胞与 10 mol/ L N E 温育 2 , 24 h α时 , 2A R mRNA 水 平 与 对 照 组 相 比 显 著 下 降. 4 h 时 下 降 到 最 低 点 , 约 下 降 了 1B μα 用 0 . 1 mol/ L70 %. 温 育 24 h 时 , 2A R 数 与 对 照 组 相 比 约 下 降 了 66 %. 1B αCalp ho stin C 预处理细胞 30 min 后再加 N E 4 h 并未引起 2A R mRNA 水平下降 , 1B μ而 1mol/ L 佛波酯刺激细胞时也能产生与 N E 所引起的相似结果. 核失控转录分析 μα显示 10mol/ L N E 处理细胞 4 h 后2A R 的转录速度与对照组相比并无显著差异. 1B α在用放射菌素 D 阻断新的 RNA 合成的条件下 ,N E 并不能加速2A R 的 mRNA 降 1B α解 . 上述结果表明 N E 引起2A R 下调的同时伴有其 mRNA 水平下降 , 这种作用 1B α是通过激活蛋白激酶 C 途径实现的. N E 并不改变2A R 基因的转录速度 , 也不直 1B 接加速其 mRNA 降解 , 但可能通过诱导某些 RNA 及其相应蛋白质的合成而间接降 α低2A R mRNA 的稳定性. 1B α 2肾上腺素受体 减敏 受体下调 基因表达 关键词1 B α(α) 2肾上腺素受体 2A R是 G 蛋白偶联受体家族之一. 大多 G 蛋白偶联受体持续激动会 11 使受体对激动剂的敏感性下降 ,产生减敏. 而导致减敏的原因可能与受体下调 、内陷及磷酸化 1 α等有关. 关于激动剂持续刺激下2A R 的减敏已有一些报道 ,但分歧较大. L urie 等曾报 1B ( ) αα道去甲肾上腺素 N E持续存在下 ,兔主动脉2A R 介导的收缩效应下降 ,但2A R 数目没 1B1B2 α有变化. 而 Izzo 等在培养的兔主动脉平滑肌细胞显示 ,N E 持续刺激可导致2A R 显著下 1B3 α调 . 与之相反 , 在 DD TM F22 细胞 , 持续激活 P KC 却能导致2A R 显著上调. 此外 ,关 1 1B α于上述改变的细胞内机制也未见详细报道. 在本文中 ,我们用仓鼠全长2A R cDNA 转染人 1B ( ) α胚胎肾细胞 H E K293得到高效稳定表达2A R 的细胞系 ,以此为模型观察 N E 持续刺激该 1B 1997205226 收稿 ,1997210210 收修改稿 ( ( ) ) 3 国家自然科学基金资助项目 批准号 :39470268与中华医学基金会 932591资助项目 3 3 联系人 α细胞对2A R 表达的影响. 1B 1 材料与方法 111 细胞转染及培养 α( 通过磷酸钙共沉淀法 ,将含有仓鼠全长2A R cDNA 除阅读框架外 ,含 5′端非翻译区的1B ) (α) 14 个碱基和全长 3′端非翻译区的质粒 p R EP8/转染 H E K293 细胞 ,得到高效稳定表达1B α 2A R 的克隆细胞. 细胞在含有 10 %新生牛血清 , 4 . 5g/ L 葡萄糖 , 200 000 U / L 青霉素和1B () 100 mg/ L 链霉素的培养液 DM ED, 5 %CO, 37 ?培养. 2 112 放射配基结合实验 ( 用 0 . 08 %胰蛋白酶消化细胞 , 将细胞收集在 10 mL 磷酸盐缓冲液 PB S 含 20 mmol/ L ) NaHPO, 154 mmol/ L NaCl , p H 7 . 6中洗 1 次 , 然后加入 20 mL PB S , 匀浆 , 20 000 ×g , 2 4 4 ?离心 10 min ,弃上清液 ,再加适量 PB S , 置冰浴中备用 . 在 0 . 1 mL 细胞膜中 , 加 13,500 125 125 μ() p mol/ L I2B E2254 IB E,加或不加 10mol/ L 酚妥拉明 ,终体积加至 0 . 25 mL ,37 ?水浴 ( ) 20 min ,加 10 mL 冷的 10 mmol/ L Tris2HCl p H 7 . 4终止反应 ,用玻璃纤维膜抽滤 ,再加 10 125 γmL Tris2HCl 洗膜 1 次 ,抽干后在计数器上测定I 的 cp m 值 , 经 Scatchard 分析求得受体最 125 ( ) 大结合容量 B 和对IB E 的离解常数max 113 RNA 提取 4 采用异硫氰酸胍2酚2氯仿抽提一步法提取 RNA. 通过分光光度计测定 RNA 样品 ,并 μ20 g 分装 , 存放于 - 70 ?待用. 114 RNA 酶保护分析 α( ) ) α( 2A R 探针是含有仓鼠2A R cDNA Xho ?/ Bam H ?片段 668bp 的 p bluescrip t 2质1B1B ββ( ) 粒 . 2肌动蛋白的探针是含有人2肌动蛋白 cDNA 片段 819bp 的 p GEM21 质粒. 应用上述 线性表达质粒及 T3 RNA 聚合酶或 SP6 RNA 聚合酶合成其反义 RNA 探针. 其探针长度分别 为 718 和 853bp . 标 记 方 法 基 本 上 按 照 Pro mega 公 司 的 操 作 手 册 进 行. 掺 入 的 同 位 素 为 32 8 αμ() μ[2P U TP 50 Ci,标记探针的比放射性强度均约为 2 . 0 ×10/ min?g. RNA 酶保护分析 () 基本上按照文献 5 方法进行. 放射自显影图经图象分析系统 L eica Q550 IW , Ger many定 ααβ量分析. 2A R 的 mRNA 水平以2A R 酶保护片段的信号强度与2肌动蛋白酶保护片段的 1B1B 信号强度之比来表示. 115 核失控转录分析 7 μ细胞经或未经 10 mol/ L 的 N E 处理 4 h 后收集. 约 2 ×10个细胞悬浮在 2 mL N P40 () (裂解液中 10 mmol/ L Tris2HCl p H7 . 4 , 10 mmol/ L NaCl , 3 mmol/ L MgCl, 0 . 5 % 体积比2 ) N P40,冰浴 5 min . 然后 500 ×g 离心 5 min , 弃上清液. 细胞核再次悬浮 2 mL 裂解液中 ,离 μ( 心 ,弃上清液. 细胞核悬浮于 200 L 储存液中 50 mmol/ L Tris2HCl p H8 . 0 , 5 mmol/ L Mg2 ) ( Cl, 0 . 1 mmol/ L ED TA 和 20 %甘油. 然后立即加入等体积反应缓冲液 10 mmol/ L Tris22 HCl p H8 . 0 , 0 . 5 mmol/ L MgCl, 0 . 3 mol/ L KCl , 5 mmol/ L D T T , 0 . 5 mmol/ L GTP , A TP , 2 32 ) μαC TP 和 100Ci 2P U TP . 在 30 ?反应 30 min . 然后在 37 ?分别用 DNase 和蛋白酶 K 消 (化 . 酚 ,酚/ 氯仿 , 氯仿抽提 ,乙醇沉淀. 沉淀溶于 2 mL 杂交缓冲液中 与 RNA 酶保护分析的 α373 许开明等 : 激动剂引起的 2肾上腺素受体下调及其部分机制 第 4 期1 6 ) αβ杂交液相同. 取约 5 ×10/ min 的标记 RNA 在 42 ?与固定在尼龙膜上的含有全长和 2肌1B 动蛋白的 cDNA 杂交 36 h . 杂交完后 ,膜首先用 0 . 1 ×SSP E 和 0 . 1 %SDS 在室温下洗 2 次 , μ每次 15 min . 然后用 2 ×SSP E 和 0 . 1 %SDS 在 65 ?洗 1 次 ,30 min . 随后在含有 10g RNase A/ mL 的 2 ×SSP E 中 ,37 ?温育 30 min . 最后该膜在 0 . 1 ×SSP E 和 0 . 1 %SDS 在室温下洗 2 次 ,每次 10 min . 洗涤完后 - 70 ?放射自显影约 36 h . 2 结果 α211 去甲肾上腺素持续作用对2A R 的影响 1 B 125 μ当用 10 mol/ L N E 持续刺激 H E K293 细胞 24 h 后 ,由细胞所制备的膜标本与IB E 特 (() ) 异性结合的 B 值从对照组的 17 . 8 ?0 . 94p mol/ mg 蛋白质下降到 6 . 0 ?0 . 76p mol/ mg 蛋 白max ( ( (() ) ) ) 质 n = 5,约下降 66 %. 而 K值无显著性改变 215 ?27和 250 ?41p mol/ L . D α212 去甲肾上腺素持续作用对2A R m RNA 水平的影响 1 B μα 10 mol/ L N E 持续刺激 H E K293 细胞可诱导2A R mRNA 水平下降. 如图 1 所示 ,N E1B α 刺激细胞 2 h 时 , 2A R 的 mRNA 水平与对照组相比显著下降 . 4 h 时下降到最低点 ,约下降1B 70 % ,直到 24 h 时 ,略有回升 ,但与对照相比仍显著下降 . α图 1 去甲肾上腺素诱导 HE K293 细胞2AR mRNA 水平下降的时间过程 1B() α( ) βaRNA 酶保护分析的放射自显影图 ; b2AR 和2肌动蛋白 mRNA 的放射自显影图经图象分析系统扫描定 1B ααβ量 , 2AR 的 mRNA 水平以2AR mRNA 的信号强度与2肌动蛋白 mRNA 的信号强度之比来表示. 对照组的 1B1B α2AR mRNA 水平当作 100 %. 数据为 3 次实验结果的平均值 ?误 1B α213 P KC 的激动剂和抑制剂对 2A R m RNA 水平的影响 1 B μ( ) α当用 1 mol/ L 佛波酯 PMA , P KC 的激动剂刺激细胞 4 h 时 , 2A R 的 mRNA 水平与 1B μ对照组相比显著下降 ,且与 N E 所引起的下降程度基本一致. 但当用 0 . 1mol/ L Calp ho stin C ( ) αP KC 的抑制剂预处理细胞 30 min 后再加 N E ,4 h 后并未引起2A R mRNA 水平下降 ,如 1B 图 2 所示. α214 NE 对2A R 基因转录速度的影响 1 B α为了观察 N E 引起的2A R mRNA 水平下降是否与转录有关 , 我们进行了核失控转录 1B α分析. 如图 3 所示 ,当 N E 处理细胞 4 h 后2A R 的转录速度与对照组相比并无显著差异. 1B α215 NE 对2A R m RNA 稳定性的影响 1 B μ 当细胞用放射菌素 D 预处理 0 . 5 h 后再加入或不加 10 mol/ L N E 持续处理细胞 4 h ,然 α图 2 P KC 的激动剂和抑制剂对2AR mRNA 水平的影响 1B() α( ) βaRNA 酶保护分析的放射自显影图 ; b2AR 和2肌动蛋白 mRNA 的放射自显影图经图象分析系统扫描定 1Bααβ量 , 2AR 的 mRNA 水平以2AR mRNA 的信号强度与2肌动蛋白 mRNA 的信号强度之比来表示. 对照组的 1B1B α 2AR mRNA 水平当作 100 %. 数据为 3 次实验结果的平均值 ?标准误. Cal 为 Calp ho stinc1B α图 3 N E 对2AR 基因转录速度的影响 1B() α( ) βa核失控转录分析的放射自显影图 ; b2AR 和2肌动蛋白 mRNA 的放射自显影图经图象分析系统扫描定 1B ααβ量 , 2AR 的 mRNA 水平以2AR mRNA 的信号强度与2肌动蛋白 mRNA 的信号强度之比来表示. 对照组的 1B1B α2AR mRNA 水平当作 100 %. 数据为 3 次实验结果的平均值 ?标准误 1B αα后测定两组细胞的2A R 的 mRNA 水平. 如图 4 所示 ,该两组细胞的2A R mRNA 水平基 1B1B 本一致. 但与未经放射菌素 D 与 N E 处理的对照组相比 ,mRNA 水平约下降了 40 %. 3 讨论 α我们的结果显示当用 N E 处理 H E K293 细胞 2 h 时 , 2A R mRNA 水平显著下降 ,4 h 时 1B α与对照组相比约下降了 70 %. 放射配基结合实验表明 N E 处理细胞 24 h , 2A R 数与对照组 1B αα相比约下降了 66 %. 这提示2A R mRNA 水平下降是导致2A R 数量下调的主要原因之 1B1B α一 . 此外 ,我们的结果还表明 N E 诱导2A R mRNA 水平下降可被 P KC 的抑制剂 Calp ho stin 1B αC 所阻 断 , 而 P KC 的 激 动 剂 ———佛 波 酯 可 起 到 与 N E 相 似 的 作 用 , 提 示 N E 导 致2A R 1B α375 许开明等 : 激动剂引起的 2肾上腺素受体下调及其部分机制 第 4 期1 α图 4 N E 对2AR mRNA 稳定性的影响 1B() α( ) βaRNA 酶保护分析的放射自显影图 ; b2AR 和2肌动蛋白 mRNA 的放射自显影图经图象分析系统扫描定 1B ααβ量 , 2AR 的 mRNA 水平以2AR mRNA 的信号强度与2肌动蛋白 mRNA 的信号强度之比来表示. 对照组的 1B1B α2AR mRNA 水平当作 100 %. 数据为 3 次实验结果的平均值 ?标准误. Act 为放射菌素 D 1B 3 mRNA水平下降是通过 P KC 途径所介导的. 该结果与 Hu 等在 DD TM F22 细胞中所观察 1 αα到的现象相反 . 他们发现持续激活 P KC 可提高2A R 基因的转录速度进而导致2A R 显 1B1B αα著上调. 导致这一差异的原因可能为在天然表达2A R 的 DD TM F22 细胞基因组中2A R 1B1 1B基因的 5′端存在某些调控元件 ,而这些元件发挥作用受 P KC 途径的影响. αα在我们转染到 H E K293 细胞中去的2cDNA 中 ,除阅读框架外 ,仅含2cDNA 5′端非翻 1B1B译区的 14 个碱基 ,不含任何反应元件 ,因此可能不会受其他因素的影响而改变转录速度. 我 α们的核失控转录实验也证实在 N E 持续作用下 , 2A R 的转录速度并无明显改变 . 因此 , N E 1B 作用 4 h 时 mRNA 水平下降 70 %应是由于 mRNA 的稳定性下降所致. 但是当我们用放射菌 α素 D 阻断新的 RNA 合成后 ,N E 并不能加速2A R 的 mRNA 降解 ,表明 N E 本身不能直接改 1B αα变2A R mRNA 的稳定性. 其可能通过诱导某些 RNA 的合成而间接降低2A R mRNA 的 1B1B6 ,7 稳定性. 最近已有学者发现了一些 mRNA 结合蛋白,当这些蛋白与 mRNA 的 3′端非翻译 8 β区的某些特异序列结合后能加速这些 mRNA 的降解. Pende 等曾报道激动剂可诱导2A R αmRNA 结 合 蛋 白 的 产 生 , 并 加 速 其 mRNA 降 解. 而 我 们 转 染 到 H E K293 细 胞 中 去 的2 1BcDNA中恰包含 3′端非翻译区. 因此 ,我们可以推测 :在 H E K293 细胞中 ,N E 可能诱导某一因 α子的产生 ,该因子可促进2A R mRNA 的降解. 当用放射菌素 D 处理细胞后 ,由于放射菌素 1B αD 阻断了该因子的转录 ,因此当再用 N E 刺激细胞时 ,N E 就不能加速2A R mRNA 的降解. 1B 参考文献 1 L urie K G , Gozo h Tsujimoto , Hoff man B B. 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