三种反义c—myc逆转录病毒表达载体的纯化,病毒包装,滴度测定

三种反义c—myc逆转录病毒表达载体的纯化,病毒包装,滴度测定 三种反义c—myc逆转录病毒表达载体的纯 化,病毒包装,滴度测定 22J%2 第6卷第3期 zo0O年 解剖科学进展 PROGRESSOFANATOMICALSCIENCES VoI.6No.3 gO00 三种反义c—myc逆转录病毒表达载体的纯化,病毒包装, 滴度测定及整合检测 曾嵘季进周沈继铭,—— (第一军医大石i室,广州5105l5) 摘要为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力,本实驻使用WizardTMDNA纯化系统对构建成 珈的-2种反义c—myc逆转录病毒表连载体进行了纯化,并经脂质体舟导包装PA317.~胞,使用NIH3T3~”胞 测定了PA317抗性细胞克隆的病毒滴度.用neo基因PCR扩增检测外j幕基园的整合情况.结果显示纯化后的 DNA遮到了真植细胞转染的要求,但其包装滴度的高低还受靶细胞 生长状恋,PA$17抽样量的高度影响.而 功的三种反义c,myc逆转录病毒表达载体pLNC— aMl,pLNC—aM2,pLNC?aM3(已另文发表.分别简 称aM1,aM2,aM3)和空载体pLNCX进行大量提 取和纯化,再经脂质体介导,分别转染PA3l7包装 细胞,测定pA317抗性细胞克隆的病毒滴度,井经 PCR检测证实外源基因已稳定整合于包装细胞基 因组上. 1材料与 1.1材料 细胞:PA317,N1H3T3均为军科院三所二室保 存. 试剂:WizardTMPlusMaxiprepsDNA纯化系 统,PCRKit,PCRmarkers(Promega)}DMEM, RPMl1640,新生牛血清,LipotectAMINE(Gibeo BRL)~G418,Polybrene(Sigma);neo基因引物(北 京赛百盛生物工程公司合成):P15’-TCCATC ATGGCTGATGCAATGCGGC一3:P25’-GAT AGAAGGCGATACGCTGCGAATCG3. 食品和器具:uv一1206紫外分光光度计(日车岛 津);CO2培养箱(Heraeus);超净工作台(苏州)}倒 置显微镜(Olympus);GeneAmpPCRSystem9600 (PerkinElmer)}6孔板,24孔板(Corning). 1.2方法 转染用质粒的大量制备和纯化.接Promega公司 北京军事医学科学琬兰所=奎 1本;敏/>cR DNA纯化系统说明书进行,然后溶解于 TE(pH8.0)中,井取lvl行琼脂糖凝胶电泳观察有 否RNA条带. 转染用质粒浓度及纯度检测.吸取2OlDNA 样品加TE至2ml,混匀后转入比色杯中,用2mlTE 校正分光光度计零点,在260rim和280rim分别读出 OD值,用公式:DNA样品浓度(~g/m1)=OD260X 5OX100计算DNA浓度,井计算OD26O/28O比值 转染用质粒的灭菌处理.用1/10体积3MNaAc (pH5.2)及2倍体积乙醇进行沉淀,75乙醇洗涤, 鼍超净台内次干,井接0.5vg/vl溶解于灭菌TE中, 一 2O?密封保存. 病毒包装.将对数期生长的PA317细胞接种于 6孔板,培养至5O,6O细胞密度.将4vl质粒及 1olLipofeetAM1NE各溶于100~1无血清无双抗 的DMEM中,再将两种溶液轻轻混合,室温静置2O ,25min.用无血清无双抗DMEM洗涤细胞1次.加 0.8ml无血清无双抗DMEM至LipofectAMINE— DNA混合物中,轻柔混匀,滴加至单层细胞上.孵箱 孵育5h后加入lml含2O新生牛血清的无双抗 DMEM.转染后24h弃转染液,换成完全培养基.转 染后48h细胞接1:8传代,井设立未转染对照组,分 别加入400~800#g/ml不等的G418进行筛选,为期 2,3周.待抗性克隆形成后,0.25的胰酶消化局 部,井用200#1加拌器吸移克隆细胞至24孔板,逐级 扩大培养. 病毒滴度测定.将扩大培养至l×lO以上的 2?.年第6卷第3期曾嵘等--~KY-?yc逆转录病毒表达载体的纯化, 病毒包装,滴度测定及整台检测?255 PA317单克隆培养事对数生长期,待细胞密度长至 7O,80,换不含G418的DMEM完全培养液,培 养24h后收集细胞上清,用孔径0.4m滤器过滤, 用于滴度测定.NIH3T3细胞按5×10细胞密度接种 至25ml培养瓶内,培养24h后经PBS冲洗,分别加 Xo.5ml待测的PA317上清,8/~g/mlPolybrene和 0.5ml含lO小牛血清的DMEM,3TC孵育3h后 补加3ml完全培养液,使Polybrene浓度为2/*g/ml, 继续培养48h,细胞按1:10传代并加入400/*g/ml G418筛选第13天倒置显微镜下计数克隆数目,并 按下列公式计算相应的PA317克隆分泌的重组逆 转录病毒滴度: #府(du/m一垂壁羞鬻盖警喜呈蓍毒堂型 基固组DNA的提取.用0.25胰酶消化下5× 10PA317细胞,PBS冲洗一遍.加入500/.1DNA提 取缓冲液(10mmol儿Tris.C1.pH8.O;._]mol/L DETA,pH8.0;20#g/mlRNA酶;0.5SDS.使用 时先不加SDS.待其它成分重悬起细胞后再加入, 并轻柔混匀),3TC,lh加入蛋白酶K100#g/ml, jO?,3h.酚,酚一氯仿,氯仿各抽提一次无水乙醇沉 淀,70乙醇洗涤1次.室温干燥,100#1灭菌水溶 解, PCR检测rico基因整合. ?建立下列50/.1反应体系 模板DNA11 引物1(1/*mol/L)0.5,d 引物2(1**mol/L)O.5#1 dNTP(2.5mmol/L)41 MgCI2(2.5mmol/L)3”1 Taq酶(2.5/1)0.5/.1 l0×PCRbuffer5 去离子水35.5/.1 同时设立不加模板的阴性对照组 ?PCR反应条件: 预变性98?5min 变性94?lmin 退火56Clmin 延伸72?lmin 3O个循环后72?7min. ?PCR反应后行1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯 下观察. 2结果 2.1转染用质粒的纯度和浓度 agarose电泳未发现明显的RNA,紫外分光光 度计检测结果如下表: Table1Purityandconcentrationoftheconstructedplasmids 2.2PA317抗性克隆的形成 经脂质体介导将pLNCX和三个反义载体导入 PA317细胞并用G418筛选的第4天,细胞开始出现 死亡;第6,7天死亡明显,且以正常对照组为甚;第 l4天,各转基因组已长成太小不等的细胞克隆(图 1),而对照组无克隆形成且己绝大部分死亡,说明基 固转导已经成功.此后逐渐将长大的抗性克隆局部 消化并转移到24孔板,再传至25ml,50ml培养瓶 图1PA317G418resistantclone 0 2.3病毒滴度的测定 G418筛选三天后可见NIH3T3细胞开始出现 死亡.一躅时未转基因的对照组全部死亡,1O天后抗 性集落出现+第13天倒置显微镜下计数并计算各组 病毒滴度如下: Tab[e2ThevirustiterofPA317(cfu/m[) Gr0u口Virustiter(e(u/m1) pLNCX aMl aM2 aM3 14,22×104 12421×10’ 2743.5×10’ 11,1.9×104 2.4目的基固整合的鉴定 所有抽取的阳性克隆细胞基因组DNA都有扩 增出一特异的长430bp的i’leo基因片段电泳条带, 而未转基因的PA317细胞DNA则无此条带(图2), 证明外源基目已在细胞基固组上稳定整合. :00年第6卷第3淞黄巨思等庆大霉索毒性辱用肝抒构影啊及其懈 护的形态学研究’263 8黄臣恩,陈维碱性或}『!IE细脆生K日子的基础与应月研充解 剖F}学进,196.22):130 9小JIl智.}.车昌末.许日武信脑虚血忙扫}t6替.景斩噬学, 1鲫3,t8(:0):13t 0杜爱萍,郜万忠,Il『艳华.等肾小管E应细胞损伤与成奸维细胞 生长里F的关系肾脏病与透析肾移植杂志,1997.6(3):221 _~10rphIJ1Igica1StudiesofToxiticEffectsofGentamicintoLiversandKidneys anditsProtectjveFunction Ifuang.,,XuZhiwen.ChertYu,ela1. ([)tpartm【l 『ofHistologyandEmbrology.GuangxiMedciMUniversiD’?Nannmg530021 Byinjectinggentamic[]~intoguineapigmuscu!ar]y.toxiticdamagesecaused.OnthesaD-I~time—basicFibrob]ast GrowthFactor(bFGF)wereused&santagonistagentsMorphologicalinfluences0Itoxiticeffectsgentam[cintOliversand kidrleysandprotectiveeffects0fbFGFv~-eTeobscrvedTheresult5showedthathFGFhadantagonisticeffectstOnephrotoxity causedbyGentamicintOacertaindegree. Keywordsgentanlicin;nephrotoxity:bFGV;antagonisticeffects;guineapig (接第255页) Res.1095.5:3810实验血谴学袅志.1995.31l1):364 5郭.李莺森.色.等K561据驰导凡II一2基固后的细袍删 PurificationPackagingtTiterandDetectionofC—mycRetrovirusExpressio nVector ZengRongLin.ZhouSheng,eld} TheFirstMilkaryMedicalUniversi:YGuangrhou.510515 AbstractInordertoobtainhightransfectiveability.retroviralconstrueture.WizardDNApurificationSVstCFlwas appliedtOthreekindsofatHisensec—mycretrovira[expressionvectorswhic husedtOtransfectPA317packagecellswith [ipofecdne?thenviraltitersw盯 cassayedandexternalgeneintegrationweFeexaminedbyneogenePCRampldicationThe rhindicatedth0tthe【】 uritiedDNAaccordedwiththedemandsofeukaryonJceelIransfection.howev,r.theviraItiters ~vcrcinfluencedbythegrowthoftargetcellsandthenumber.fPA317samplin ginthemeanwhile.NeogenePCR amplificationwasalsoindicatedasensitive,economicalandreliabletestforgeneintegration Keywordsnlyc:rctrirUSVCCtor