猫细小病毒CC_1株VP1基因克隆与序列分析

猫细小病毒CC_1株VP1基因克隆与序列分析 猫细小病毒 CC21 株 VP1 基因克隆与序列分析 1 ,2 1 3 1 1 2 1 ,2李爽,袁宝,肖书奇,任文陟, 张嘉保, 赵志辉, 雍海平 ( 1 . 吉林大学实验动物中心 ,长春 130062 ; 2 . 吉林大学畜牧兽医学院 ,长春 130062 ; )3 . 中山大学生命科学学院 ,广州 510275 ( ) 摘要 :根据 GenBa nk 登录的猫细小病毒 CU24V P1 基因序列 ,设计了 1 对引物 ,用 PCR 技术对 V P1 基因进行整体扩增 , 将扩增产物纯化后克隆入 P GM2T 载体 ,通过酶切 、PCR 和测序进行验证 。结果明 ,测序拼接得出 V P1 基因的序列长度约 为 2306 bp ,该基因的 O R F 总长为 2184 bp ,编码 727 个氨基酸 ,应用 DN A Sta r 软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的 V P1 基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序 列进行比对分析 , 发现 CC21 株与国内 XJ21 株的核苷 酸和氨基酸同源性均为 99 . 3 % 。 关键词 :猫细小病毒 ; V P1 基因 ;序列分析 () 文章编号 :167127236 20080820040204 中图分类号 : Q785 文献标识码 : A (猫细小病毒又名猫泛白细胞减少症病毒 f eli ne ,是目前肉食兽细小病毒中感染范围最宽 、致 和浣熊 病性最强的一种病毒 ,并且由 F PV 引起的猫泛白细 ) p a nle ukop e nia vi r u s , F PV 、猫 瘟 热 病 毒 、猫 传 染 () 胞减少症存在于世界各地 Ba r ker 等 ,1983。F PV 性肠炎病毒 ,能引起猫科动物的一种急性高度接触 呈二十面立体对称结构 ,直径 20,40 n m ,病毒衣壳性致死性传染病 。临床上以高热 、呕吐 、腹泻 、脱水 ( 蛋白由 V P1 、V P2 、V P3 三 种 结 构 蛋 白 组 成 侯 云 和明显的白细胞减少等为主要特征 。在自然条件下 ) 德 ,1990。为了更进一步了解该株病毒生物学特性 能感染猫科 、鼬科 、浣熊科等多种动物 ,如虎 、豹 、狮 的分子基础及流行病学意义 ,为以后的研究奠定基 础 ,我们应用 PCR 扩增的方法对该毒株 V P1 片段 收稿日期 :2008201207 的全基因序列进行测定 ,并与已报道的国内外分离 ( ) 作者简介 :李爽 1980 - ,女 ,河南人 ,硕士生 ,研究方向 :实验动 毒株进行了核苷酸和氨基酸序列同源性的比较和系 物质量监测 。 统发育进化树分析 。 通讯作者 :任文陟 。 12 Pengwei H , Ti bo r F , Wei mi ng Z , et al . No ro vi r us a nd hi sto2 13 Vi nje J , Koop ma n s M P . Molecula r det ectio n a nd epide molo gy of 2st r uct ured vi r u se s i n o ut brea k s of ga st roent eriti s i n small ro undbloo d gro up a ntigens : De mo nst ratio n of a wide sp ect r u m of st rai n ( ) specificitie s a nd cla ssificatio n of t wo majo r bi ndi ng gro up s a mo ng t he Net herla nds[J ] . J Inf ect Di s , 1996 ,174 3:610,615 . ( ) multiple bi ndi ng pat t er n s[J ] . J Vi rol ,2005 ,79 11:6714,6722 . 3’RACE Ampl if icat ion an d Sequence Analysis of a Stra in of Norovirus 1 ,2 2 2 2 2L I Ya 2ji ng, L IN Xia ng2mei, WU Shao2qia ng, L IU J ia n,M EI L i n (1 . College of L if e Science , Hebei No r mal U niver sit y , Shijiazhua ng 050016 ,China ; )2 . Instit ute of A nimal a nd Pla nt Q ua rantine , Chine se Academy of Inspectio n a nd Q ua rantine , Beijing 100029 ,China Abstract : No ro vir us i s a n impo rta nt zoo no tic pat ho gen t hreat ening human healt h . To serve a s po sitive co nt rol fo r t he mo2 lecular biolo gical exa minatio n of no ro vi r us inf ectio n a nd f acilitate deducing t he o rigin of t hi s i solate , t he to tal RN A of a f ece s ( sample wa s ext racted a nd used a s template fo r rever se t ra nscrip tio n. The fir st st rand cDN A wa s a mplified by 3’RA C E rapid ) a mplificatio n of cDN A 3’endsusing gene specific p rimer J V12 a s fo rwa r d inner p rimer and 3’RA C E backwa r d i nner p rimer . The a mplico n wa s 3282 bp in lengt h j udged f ro m aga ro se elect rop ho resi s. The amplico n wa s ligat ed to t he Pro mega T2ea sy vec2 to r and sequence deter mined. The deter mined nucleo tide sequence wa s t hen a nalyzed by bla st o nline . Sequence a nalysi s indica2 ted t hat t he isolated virus st rain belonged to Norovirus G?24 cluster and has t he same origin wit h t he isolate in J apan. 3’RACE a mpli2ficatio n esta bli shed a ba si s fo r experimental detectio n a nd f urt her re search of No ro vir us. Key words : no ro vir us ; 3’RA C E ; sequence analysi s ; o rigin 1 材料和方法 1 . 1 病毒 、细胞和主要试剂 猫细小病毒 CC21 株 由本实验室分离保存 。Ex Ta qDN A 聚合酶 、Ba m H ?和 Xho ?限制性内切酶购自 Ta ka ra 公司 , E col i αD H5宿主菌为本实验室保存 , P GM2T 载体 、F PV DN A 提 取 试 剂 盒 购 自 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 , DN A 凝胶回收试剂盒 、质粒小量抽提试剂盒购自美 国 O mega g 公司 。 1 . 2 F PV CC21 株病毒 DN A 的提取 参考以往的 ( 方 法 刘 维 全 等 , 2001 ; Pe rei ra 等 , 2000 ; 殷 震 等 , ) 1997略加改进提取 F PV CC21 株 DN A 。 引物设计 参照 Ge nBa nk 中已登 录 的 PCR 1 . 3 () F PV 病毒毒株 登录号为 M38246V P1 全基因 序列设计了 1 对引物 , P1 : 5’2 C TC GGA TCCA C G2 A T GGCA CC TCC GGCA A A GA G23’, P2 :5’2A A C2C TC GA GC TA GGT GC TA GT T GA TA T GTA A TA A A C 23’,由上海生工合成 。 1 . 4 V P1 基 因 PCR 扩 增 取 上 述 所 提 的 病 毒 DN A , PCR 循环参数为 96 ?预变性 4 mi n ; 95 ?变 性 45 s ,69 ?退火 50 s , 72 ?延伸 160 s ,35 次循环 ; 72 ?终延伸 10 mi n 。 1 . 5 克隆与序列分析 PCR 产物的克隆按常规的 方法进行 , PCR 产物经 0 . 8 %的琼脂糖凝胶电泳纯 化后 , 其 产 物 用 DN A 凝 胶 回 收 试 剂 盒 回 收 , 与 P GM2T 载体 16 ?连接过夜 。连接产物按常规方法 α转化 D H5感受态细胞 ,在含有 A M P 、X2gal 、IP T G 的 LB 平板培养基上培养 14 h 。挑取白色菌落接种 到 5 ml LB 培养基中 ,振摇培养后小量提取质粒 ,进 行阳性克隆株的 PCR 鉴定及单 、双酶切方法鉴定 。 ( 经鉴定为阳性的克隆进行序列测定 由上海生工生 ) 物技术有限公司完成。将测序结果与不同毒株的 2 . 3 序列测定及核苷酸 、氨基酸同源性分析 经 V P1 基因进行核苷酸和氨基酸的同源性分析 。 PCR 和酶切鉴定后的阳性重组质粒经上海生工生 用 1 . 6 细小病毒 V P1 基因遗传进化 树的 构 建 物公司测序 , CC21 株 V P1 基因核苷酸序列长度为 DN A St a r 软件处理数据 ,构建进化树 。( ) 2306 bp ,此序列含有一个阅读框 O R F,但阅读框 2 结果内含有 72 个内含子 ,去其内含子 ,该基因的 O R F 总 2 . 1 V P1 基因 PCR 扩增产物 用上述引物成功 ( ) 长为 2184 bp 图 4, 共 编 码 727 个 氨 基 酸 的 多 肽 扩增出一条约 2 . 3 k b 的特异性条带 ,与设计的扩增 () 图 4,推算出的蛋白分子量约为 80 . 30 kD ,等电点( ) 片段大小相符 图 1。无特异性条带出现 ,表明特 ( ) 7 . 51 ,O R F G + C%含量为 36 . 77 % 。将 CC21 毒 异性的扩增了目的基因 。( 株 V P1 基 因 与 7 个 参 考 毒 株 GT22 株 、XJ21 株 、 2 . 2 PCR 产物的克隆与鉴定 PCR 产物纯化后经 CU24 株 、PV F PV 株 、B F PV21 株 、F PV223 株 、C PV2连接 、转化 , 平板 筛选 菌 落 , 小 量 提取 重组 质 粒 , 用 b 株 , 在 Ge nBa n k 中 注 册 号 分 别 为 DQ00301 、PCR 鉴定及限制性内切酶 Bam H?和 Xho?分别进行 EF9886601 、M38246 、M10824 、U 22185 、U 22187 、单 、双酶切 ,电泳鉴定 PCR 扩增出的片段长度为 2. 3 ) M38245V P1 基因的 O R F 进行比 较 , 结 果 发现 核 () kb 左右 图 2,单酶切片段长度均为 5. 3 kb 左右 ,双 ( ) 苷酸的同源性在 98 . 8 %, 99 . 3 % 图 5, 氨基酸同 () 酶切片段长度分别为 2. 3 和 3. 0 kb 左右 图 3,与预 () 源性在 98 . 2 %,99 . 3 % 图 6。 期的扩增片段和 P GM2T 载体大小相符 。 XJ21 株的遗传距离较近 ,与 C PV2b 株距离较远 ,说 2 . 4 进化树分析 根据各毒株的 V P1 基因编码区 明 F PV CC21 株与 B F PV21 株和 XJ21 株的亲缘关 核苷酸序列 , 应 用 DN A St a r 软 件 绘 制 系 统 发 育 树 () 图 7 。可 以 看 出 F PV CC21 株 与 B F PV21 株 和 系较近 ,与 CPV2b 株的亲缘关系较远 。 图 4 CC21 株 VP1 基因核苷酸及其编码氨基酸序列 3 讨论V P1 基因进行了扩增 、克 隆 、测序 和 序列 分析 。从 F PV 为单股 DN A 分子 ,长约 5200 nt 。在基因 序列分析可以看出 , F PV CC21 株的 V P1 基因阅读 组中含有两个启动子 框总长为 , 它能利用宿主细胞的 RN A 2184 bp ,共编码 727 个氨基酸的多肽 。从 ( ) 聚合酶 ?分别启动结构蛋白 V P1 和 V P2和非结 V P1 基因的序列比较 、序列同源性分析和系统进化树 ( ) ( 构蛋 白 N S1 和 N S2 编 码 基 因 的 转 录 St udde r t 分析可知 , FPV CC21 株与 B FPV21 株和 XJ21 株的核 ) 等 ,1973。F PV 病 毒 粒 子 衣 壳 蛋 白 是 由 V P1 和苷酸同源性较高 ,分别为 99. 1 %、99. 3 % ;推导的氨基 V P2 蛋白分子 构 成的 , V P1 蛋 白基 因和 V P2 蛋 白 酸的同源性也较高 ,均为 99. 3 %。而与 CPV2b 株的 μ( ) 核苷酸和氨基酸同源性较低 ,分别为 98. 8 %、98. 2 %。 基因是由位于 F PV 基因组图距单位 40 40 m处 的启动子转录 ,转录后形成一条 m RN A 前体 ,经选系统进化树分析表明 , FPV CC21 株与 B FPV21 株和 XJ21 株的亲缘关系较近 ,与 CPV2b 株的亲缘关系较 择性剪切形成 V P1 和 V P2 蛋白 m RN A ,最后分别 ( ) 翻译形成 V P1 和 V P2 蛋白 Pa r ri sh 等 ,1991。本 远 。所以本试验的研究从分子生物学的角度对临床 研究采 用 PCR 方 法 对 长 春 地 区 F PV CC21 株 的 和流行病学的研究具有重要意义 。 定了一定的基础 。 图 7 FPV CC21 株 VP1 和其它细小病毒 VP1 的 系统发育树分析 图 5 8 株 FPV VP1 基因核苷酸序列同源性比较 注 : ?1 , FPV CC21 ; 2 ,B FPV21 ; 3 , CPV2b ; 4 , CU24 ; 5 , FPV223 ; 6 , 参 考 文 献 GT22 ;7 , PV FPV ;8 , XJ21 。 ?图中上三角数据表示不同毒株 ( ) ( ) 间的同源性 %,下三角数据表示不同毒株间的差异性 %。 1 刘维全 ,范泉水 ,江禹 ,等. 肉食兽细小病毒通用 PCR 诊断技术的 下同 。 ( ) 建立. 中国兽医学报 ,2001 ,21 3:249,251 . ( ) 2 萨姆布鲁 克 , 等著. 黄 培堂 主译. 分子 克隆 实验指 南 第 3 版 [ M ] . 北京 : 科学出版社 , 2002 , 96,99 . 3 Ba r ker I K , Po vey R C , Voi gt D R. Re spo n se of mi nk , skun k , red fo x a nd raccoo n to i noculatio n wit h mi n k vi r u s ent eriti s , f e2 li ne p a nleukop enia a nd ca ni ne p a r vo vi r us a nd p revalence of a nti2 bo dy to pa r vo vi r u s i n wil d ca r nivo re s i n Ont a rio . Ca n J Co mp ( ) Med , 1983 ,47 2: 188,197 . 4 L a n H M , Kri sti nal T , Fra ncoi se N . A uto mo no no us p a r vo vi r u s vecto r s[J ] . Met ho ds , 2002 ,28 :168,181 . 5 Ma xwell I H , Ma xwell F . Par vo vi r u s L u ? t ra nsduci ng vecto r s packaged by L u ? ver sus F PV cap sid p ro t ei n . J Gen Vi rol ,2004 , 图 6 8 株 FPV VP1 基因氨基酸序列同源性比较 85 :1251,1257 . 6 Pa r ri sh C R , Aquadro C F , St ra sshei m M L , et al . Rapid a nti2 对细小病毒结构蛋白基因序列的研究 ,为进一 genic2t ype replace ment and DN A sequence evol utio n of ca ni ne 步研制细小病毒的基因疫苗提供了理论依据 。 pa r vo vi r u s. J o ur nal of Vi rolo gy ,1991 ,65 :6544,6552 . 目前 ,细小病毒科的几种病毒已作为载体用于人类 7 Perei ra C A , Mo nezi T A , Mehnert D U , et al . Molecula r cha rac2 () 肿瘤的治疗 L a n H 等 ,2002。相关研究报道 , F PV t erizatio n of ca ni ne p a r vo vi r u s i n Brazil by pol ymera se chai n reac2 ( ) tio n a ssay [ J ] . Vet eri na r y Micro biolo gy ,2000 ,75 2:127,133 . V P1 基因结 构蛋 白 对人 类肿 瘤 的抑 制有 一定 的 作 St udder t M J , Pet er so n J E. So me p rop erties of f eli ne pa nleu ko2 8 ( ) 用 Ma xwell 等 ,2004。因此 ,本试验也为此工作奠 ( ) penia vi r us. A rch Ge sa mt e Vi r u sfo r sch ,1973 ,42 4:346,354 . Clon ing an d Sequenc ing of VP1 Gene of Fel ine Parvovirus CC21 Stra in 1 ,2 1 3 1 1 L I Sh ua ng, YU A N Bao, XIA O Sh u2qi, R EN We n2zhi, Z HA N G J ia2bao, 2 1 ,2Z H A O Zhi2h ui, YO N G Hai2pi ng (1 . L abo rato r y A ni mal Center of J ilin U niver sit y , Changchun 130062 , China ; 2 . College of A nimal Science and Vet erina r y Medicine , J ilin U niver sit y , Cha ngchun 130062 , China ; )3 . College of L if e Science , Zho ngshan U niver sit y , Gua ngzho u 510275 ,Chi na Abstract : To a nalyze t he sequence of V P1 gene of Feline pa rvo vir us CC21 st rain a nd co mpa re wit h t hat of rep resentative vi2 ( ) r us st rain. Acco r ding to t he repo rted co mplete nucleo tide sequence of F PV CU24in GenBank ,a pair of p rimer s were de signed a nd synt hesized. V P1 gene of i solate wa s a mplified. The p ro duct s of PCR were clo ned into P GM2T vecto r . t he po sitive clo ne wa s identified bu enzyme cut ting , PCR and sequencing. The w hole sequence of V P1gene wa s a nalyzed usi ng DN A St ar sof t wa re. The result s indicat ed t hat t he V P1 gene wit h 2306 bp lo ng had a single opening read f rame 2184 bp in lengt h and co ded a polypep tide of 727 ami no acids. The sequence analysi s demo nst rated t hat rep re sent ref erence st rains loaded do w n f ro m GenBa nk , t he re sult of O R F sequence a nal ysi s i ndicated t hat CC21 st rain exhibited 99 . 3 % ho molo gy of t he nucleo tide s and ami no acid wit h t hat of t he XJ21 st rain in o ur co unt y. To a nal yze t he sequence of V P1 f ull gene ,have a significa nce in clinic a nd epidemiolo gical st udy. Key words : f eline p arvo vir us ; V P1 gene ; sequencing a nalysi s