去甲斑螯素对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响（可编辑）

去甲斑螯素对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响（可编辑） 去甲斑螯素对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则,承担相应的法律责任。 研究生虢专峁艴章:圈交二 日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了 文中特别加以标注等内容外,文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 一妣哿哟聊楫瓢敖 日 矽//年舌月 \ 目 录 中文摘要? 英文摘要? 研究论文 去甲斑蝥素对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响 前言? 日舌? 材料与方法? 结果? 附图 附表? 讨论? 结论? 参考文献综述 线粒体途径与肝星状细胞凋亡??.. 致谢 .一??中文摘要 去甲斑蝥素对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响 摘 要 肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,肝星状细胞 ,活化是肝纤维化形成的中心环节。等【】认为 活化后很难将其由活化逆转为静息状态,主要通过诱导凋亡可使其 数量减少,从而逆转肝纤维化。肝星状细胞已成为肝脏纤维化机制及抗肝 脏纤维化研究的热点。斑蝥是斑芫青属昆虫的俗称,斑蝥素 是一种半帖烯毒素,是斑蝥抗肿瘤的有效成份;去甲 斑蝥素 是斑蝥素的衍生物,由马来酸与呋喃按 .人工合成的【。大量体外实验研究表明可诱导、 、.等肿瘤细胞凋亡【,还具有抗器官组织纤维化作 用,文献报道其能够延缓肾间质纤维化【币】。但在肝脏纤维化的研 究,国内外尚未报道。本实验通过观察对大鼠的肝星状细胞形态、 增殖及凋亡的变化,探讨对肝星状细胞增殖、凋亡的影响及其可 能的机制,为今后在肝脏纤维化方面的治疗提供临床依据。 目的:本实验主要通过不同浓度的干预体外培养的大鼠肝星 状细胞,研究其对活化的肝星状细胞增殖、凋亡及周期的影响;以及对肝 星状细胞线粒体膜电位 ,、 活性的影响。 方法:应用法检测对活化的肝星状细胞增殖的影响; 染色普通电子显微镜及荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学 变化;流式检测细胞凋亡率及周期;.染色流式及激光共聚焦显微镜 检测细胞线粒体膜电位;酶标仪检测酶活性。 对增殖的影响: 法检测细胞增殖显示, 结果: / 不同浓度.蚓、.州、.州、.蚓、. 的去甲斑蝥素分别作用、、与对照组相比值明显降低, ..、..、..、.士.、.. ..,.,.士.、..、.士.、.士.、 、. .、 .. . . 士.、.. ,., .中文摘要 ..、.士. .士.,.,总体均数差异有统计学意 义,不同时间对活化的肝星状细胞增殖有抑制作用,且存在一定的剂量与 时间依赖性。抑制率同样具有时间与剂量依赖性,.%.%、 .%士.%、.%士.%、.%士.%、.%.%; .%士.%、.%.%、.%士.%、.%:.%、 .%土.%:.%士.%、.%士.%、.%士.%、 .%士.%、.%土.%,后开始抑制增殖,抑制 作用明显增强。 去甲斑蝥素对凋亡的影响: ?普通电子显微镜及 染色荧光显微镜下检测细胞凋亡形 态显示:干预后,细胞核浓缩、凋亡小体出现,说明 可诱导活化的肝星状细胞凋亡,./作用、、细胞 %士.%、.%士.%、.%. 凋亡率. %升高,与空白 对照组.%士.%相比有统计学差异尸.。 ?流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率结果示:.州、.蚓 、.“‖干预后对细胞周期的影响显示:与对照组相比, /期细胞数所占逐渐增多.%士.%、.%:.%、.% 士.% .%.%,.,期细胞呈现下降的趋势.% 士.%、.%.%、.%士.% .%士.%,.: 而细胞凋亡率.%士.%、.%士.%、.%士.%随药物 浓度升高逐渐增高,与对照组.%士.%相比,有显著的统计学差 异尸.;当加入..后,细胞凋亡率.%士.% 较.蚓组.%.%有所下降.。 ?.试剂盒流式细胞仪法检测细胞的早期凋亡线粒体膜电位改变结果 、、与阴性对照组 示:.“‖去甲斑蝥素组分别作用于 相比线粒体膜电位均降低.土.、..、..较 阴性对照组..相比,均有统计学差异尸.。.叫 去甲斑蝥素组分别作用于 在激光共聚焦显微镜下观察结果显示 药物干预组..、阳性对照组..较阴性对照组. 土.相比有显著性差异尸.。 ?活性检测显示:. ‖的去甲斑蝥素作用活化的肝星状细 中文摘要 胞、、、后,活性..、..、 ..、..较对照组.士.相比明显升高,加入 ..后.土.较去甲斑蝥素组有所下降, 活性总体差异显著有统计学意义.,说明去甲斑蝥素可影响 活性。 结论: ?体外细胞培养研究表明,去甲斑蝥素可抑制活化的增殖,其抑 制作用具有一定时间和剂量依赖性。 ?去甲斑蝥素可使活化的凋亡,可影响细胞周期,并使细胞生长阻 滞于/期。 ?去甲斑蝥素通过线粒体膜电位下降,激活酶,促进细胞凋亡。 关键词:肝星状细胞;去甲斑蝥素;细胞凋亡;细胞周期;线粒体膜 电位;英文摘要 ,... ,,, ? .. . ? ,一, . . . .甩, ?, , . . ... . , .. .,.: , ,, . :; 英文摘要 ; / ? .;.: :? .蚓 .,. /,. /,. /, /: ,尸., .., ..,..,..,.. ..,., . .士.,.士.,.士.,..,.. .,.,.土.,.土.,..,..,. . ..,.., , ? . ?爹? . ,,,.%士.%,.%士.%, .%士 .%士.%, %, .%士.%,./硅.%,.%. .%,.%士.%,.%士.%,.%士.%;.%士.%, ./硅.%,./硅.%,.%土.%,.%士.%, , ; . ./ :? ./ .舱./ ,,, 英文摘要. . .%士.% ,, .%士.%,.社.%,.%.% 畔., ./ ,. ? : /, ? .%士.% .%士.%, .%士.%, . %土. / %,. .%士.% .%士.%,.%士.%, .%士.%. / ., .. ,,.%士.%,.%土.%,.%士.% .%土.%,., .%:.%, ?? ..,尸....? ./ : ?. . . .../,,.士.,.士.,.... ./ 一 , ’ 英文摘要 ????????????????????????????????????????????????????一一一一 .士. .士., ./ . 士..尸..? .士. ,./ ,,,.士., 士. .士.,. ,.士.., ., , 。..士. ..? ??. : ?, . ? .. ? .. : ;; ; ; ;。 研究论文 去甲斑蝥素对大鼠肝星状细胞增殖与凋亡的影响 上.‘一 刖 吾 慢性肝病是严重危害人类健康的一类疾病,而肝纤维化是是慢性肝病 发展过程中的一个共同的病理特征。研究认为肝脏纤维化的关键即肝星状 ,的激活,的激活成为肝纤维化的 细胞 核心事件。一旦被激活便会合成大量的细胞外基质 ,,而合成过多或降解不足使二者失衡,进而引起肝脏 内大量的纤维结缔组织沉积,导致肝纤维化【】。通过减少活化的肝星状细 胞数量,抑制其增殖,促其凋亡可能被认作是治疗肝纤维化一种有效途径。 目前研究的热点即:一方面应用药物干预来促进肝星状细胞凋亡的研究, 另一方面对肝星状细胞凋亡机制的研究。 去甲斑蝥素 是斑蝥素的衍生物,由马来酸 与呋喃按?人工合成的,是我国首先合成的具有独特抗肿瘤活 性和升高白细胞作用,临床上主要用于治疗肝癌、食管癌、贲门癌等,并 可以抑制乙型肝炎病毒的复制有一定的抑制作用,大量体外实验表明去甲 斑蝥素可诱导,,.,.,,, 肿瘤细胞凋亡,研究表明具有抗炎、调节免疫、抗器官组 织纤维化的作用,去甲斑蝥素可延缓蛋白超负荷,肾病大鼠肾间质 纤维化,但是在肝脏纤维化的应用国内外未见报道。 本实验主要将体外培养肝星状细胞活化后,给予去甲斑蝥素处理,应 用方法检测的增殖;染色法普通电子显微镜及 荧光显微镜下观察凋亡形态;流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期; 。染色流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位变化;酶标 仪测定酶活性;进一步研究去甲斑蝥素能否抑制增殖而促 进凋亡,从而起到抗肝纤维化作用并探讨其可能的机制,为今后去 甲斑蝥素应用肝纤维化的临床治疗提供了依据。研究论文 材料与方法 材料 . .细胞系:购自北京友谊医院肝病研究所,其表型为活化的 ,置于液氮中冷冻保存。 .主要仪器 细胞培养瓶 公司 六孔培养板 公司 九十六孔培养板 公司 一次性细胞培养皿 公司 电热恒温水浴箱 北京市长风仪器仪表厂 .净化工作台 苏州安泰空气技术公司 二氧化碳培养箱 .荧光显微镜 . 高速台式冷冻离心机 德国 高速离心机 德国 ‘ 电子天平 分光亮度计 上海第三分析仪器厂 .气浴恒温振荡器 江苏金坊市亿通电子有限公司酶标仪 芬兰 流式细胞仪 公司 美国 . 祭司激光共聚焦扫描显微镜 .试剂 培养基 胎牛血清 杭州四季青公司 胰蛋白酶 华美生物工程公司 青霉素、链霉素 华北制药 牛血清白蛋白 考马斯亮蓝. 天象人生物工程公司 去甲斑蝥素纯度% 细胞凋亡.染色试剂盒 研究论文 活性检测试剂盒 抑制剂? 线粒体膜电位检测试剂盒 二甲基亚砜 主要试剂的配制 . ./ :.,加蒸馏水至,高温灭菌后,室温保 存。 . /牛血清白蛋白..,./,溶解 后.保存。制作蛋白曲线时,用./ 进行倍稀释成 /,.?保存。 .考马斯亮蓝工作液:考马斯亮蓝. 溶于%乙醇中, 加入%磷酸混匀,配成考马斯亮蓝原液,?保存。根据需要按 照原液:%磷酸:三蒸水::的比例配制适量的工作液,现配现 用。 . : .,。 .,‘ .,双蒸水 定容至。 . / 溶液:四唑氮蓝溶于./、为 .的中,溶液体积为.在电磁搅拌机上搅拌,用. 的微孔滤器除菌,分装,?保存,两周内有效。 方法 .细胞的冻存 使用.%胰蛋白酶消化细胞,在完全生长培养基中,再次悬浮分离 细胞,确定有活力细胞数。离心沉淀细胞。移液管移去 上清到最小体积,以 细胞?。密度,在冻存液中悬浮细胞。 分装进冻存管,将冻存管置于湿的冰上或放入?冰箱中,约分钟后, 放入.?冰箱中十几分钟,细胞以??。的速度进行冷冻,可以通过 可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到.?~.?的冰箱 中,然后转移到液氮中贮存。 .细胞的复苏和传代 取出贮存细胞,?水浴中快速融化。把冻存细胞的混合物研究论文 加入到大约完全生长培养基中,轻轻混匀。离心。 弃去上清。接种于含%胎牛血清、?。青霉素、?。链霉 素、?谷氨酰胺及?’ 的培养液中,。、 %条件下培养。接种的细胞密度约活细胞?~。当细胞生长 至单层致密状,约%汇合成片时。用.%胰蛋白酶消化后以:传 代,换液,再次传代。 . 法检测去甲斑蝥素对的增殖的影响。 ..实验分组 将对生长期以每孔×个细胞接种于孔板,在?、 %条件下呼育,后换无血清培养液再孵育,使 细胞基本同步化于期后再进行分组。弃上清,分组每组设复孔 如下: ?对照组.%血培养液 ?./去甲斑蝥素组./去甲斑蝥素,.%血培 养液 ?.“/去甲斑蝥素组./去甲斑蝥素,.%血清培 养液 ?./去甲斑蝥素组./去甲斑蝥素,.%血清培养 液 ?./去甲斑蝥素组./去甲斑蝥素,.%血清培养 液 ? .卜/去甲斑蝥素组 .卜/去甲斑蝥素,.%血清培 养液 分别孵育、、后进行分析。 .. 法实验步骤 ...按上述方法分组和处理后,每孔加入溶液/, 继续培养后,终止培养。 ...吸去培养液,然后每孔加入二甲基亚枫,震荡 分钟,使结晶充分溶解。 ...同时设置调零孔培养基、、二甲基亚砜。 ...在酶联免疫检测仪处测量各个孔的吸光值值。以研究论文 处的值代表细胞数,值高表示细胞多。以对照组的值与 处理组值的差值与对照组值的比,代表对生长的抑制率。 . 染色后用荧光显微镜检测细胞凋亡。 ..实验分组 取普通洁净盖玻片于%乙醇中过夜,在无菌超净台内吹干,将盖 玻片置于无菌的一次性六孔板中,将指数生长期细胞按的细胞密度 种入盖玻片中,培养至约%.%满时,弃培养液,每孔加入不含 血清的培养液继续培养,使细胞基本同步化于期后再进行 分组。按下列分组每组复孔进行处理: ?对照组.%血清?培养液 ?去甲斑蝥素组.肛/去甲斑蝥素组、.%血清培养液 ?去甲斑蝥素组.“/去甲斑蝥素组、.%血清培养液 ?去甲斑蝥素组.“‖去甲斑蝥素组、.%血清培养液 ..上述分组,分别给予细胞干预、、后吸尽,培养液,用 洗两遍,每次分钟,吸尽洗液。 ..加入. 染色液,染色分钟,用摇床摇动。 ..滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的各组盖玻片, 尽量避免气泡。 ..在荧光显微镜检测的凋亡情况。在每张玻片低倍镜下上、下、 左、右五个视野,在高倍镜下摄片观察,检测凋亡率。细胞凋亡时,染 色质会固缩,形成凋亡小体, 染色后,在荧光显微镜下观 察正常细胞的细胞核呈正常的蓝色,而凋亡细胞的细胞核呈致密浓缩, .软件测每个视野 或碎块状致密浓染,颜色有些发亮。用. 细胞数、发白细胞核数即凋亡细胞数,测凋亡率。 .流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期。 ..流式细胞仪膜联蛋白./碘化丙啶法 检测细胞凋亡率: ...取对数生长期细胞,接种于培养瓶中,待细胞贴壁后,用血清饥饿 法使细胞同步化于期后,进行分组,加入不同浓度的,作用 后收集细胞,按试剂盒说明书处理细胞,具体操作如下:用漂洗 ?和 次,重悬细胞于“ 中,加入研究论文 山进行染色,。避光后,将细胞置于激发光为波长 .型流式细胞仪检测,上机测定时获取×个以上细胞,重 复三次,应用 软件分析,染色后将细胞分为个亚群:活细胞 包膜完整,磷脂酰丝氨酸,无外化,为. ./.亚群;凋亡细胞膜完整,外化,为./.亚群;坏死细胞 膜不完整,外化,为./亚群。分组如下: ?对照组.%血清培养液 ?./去甲斑蝥素组./去甲斑蝥素、.%/清培 养液 ?./去甲斑蝥素组.“‖去甲斑蝥素、.%血清培养 液 ?./去甲斑蝥素组./去甲斑蝥素、.%血清培养 ’ 液 .%血清培养液、 ?..组./去甲斑蝥素、 ?。 ..流式细胞仪测定细胞周期: ...取对数生长期细胞,接种于培养瓶中,待细胞贴壁后,用血清饥 饿法使细胞同步化于期后再进行分组分组除?外其余同上,并加 / 入不同浓度的,后收集细胞,用漂洗次,重悬浮于 乙醇。固定过夜,加入酶终浓度为/,在?反应, 避光加入浓度为/标记溶液染色~后,应用流式 细胞仪美国 公司上机进行检测。 .线粒体膜电位.染色流式细胞仪检测法: ..实验分组 将指数生长期细胞按 的细胞密度种入培养瓶中,培养至约 %.%满时,弃培养液,每孔加入不含血清的培养液继续 培养,使细胞基本同步化于期后再进行分组。按下列分组每组 瓶进行处理: ?阴性对照组.%血清培养液 ?不同时间去甲斑蝥素组./去甲斑蝥素组、.%血清培 养液研究论文 ..阳性对照组的处理 在阳性对照组装载.前,把线粒体电子传递链抑制剂 按照:的比例加入到细胞培养液中,稀释至., 预处理。 .. .的装载 当细胞长满至约%时,给细胞换液,用不含血清的培养基使细胞 同步化,干预组分别培养、、后,将各组细胞用.%胰蛋 白酶消化,每瓶各收集×细胞做样本。,。,离心分钟,每个 样本中加入.培养液再悬,加入.的?工作液,充分混匀, 放入?细胞培养箱中孵育分钟。。,离心分钟,由.染色缓冲 液洗涤两遍。每孔加入培养液。 .. 分钟内用流式细胞仪检测各样本红、绿荧光强度比。在线粒体膜 电位较高时,.主要聚集在线粒体基质中,形成聚合物,可以产生红 色荧光;在线粒体膜电位较低时,.不能聚集在线粒体基质中,此时 一为单体,可以产生绿色荧光;用红、绿色荧光强度比的变化来检测 线粒体膜电位的变化,来衡量线粒体去极化的。检测.单聚体时 把显微镜的激光设置,发射光设置为,检测.聚合物时, 把激发光设置为,发射光设置为激发光。 .线粒体膜电位.染色激光共聚焦显微镜检测法。 ..实验分组 取普通洁净盖玻片于%乙醇中过夜,在无菌超净台内吹干,将盖 玻片置于无菌的一次性六孔板中,将指数生长期细胞按的细胞密度 种入盖玻片中,培养至约%.%满时,弃培养液,每孔加入不含 血清的培养液继续培养,使细胞基本同步化于期后再进行 分组。按以下分组每组复孔进行处理: ?阴性对照组.%血清培养液 ?阳性对照组.%血清培养液、 ?去甲斑蝥素组.%血清培养液、./去甲斑蝥素 ..阳性对照组的处理同上 . .的装载 各组分别干预后,吸取各孔的培养液,用洗涤后,分别加研究论文 入%胎牛血清的培养液、 .工作液,充分混匀后, 放入?细胞培养箱中孵育分钟。吸取培养液,由?染色缓冲液 洗涤两遍。每孔加入培养液。 ..激光共聚焦扫描显微镜下观测 在线粒体膜电位较高时,一主要聚集在线粒体基质中,形成聚合 物,可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,.不能聚集在线粒 体基质中,此时.为单体,可以产生绿色荧光;用红、绿色荧光强度 比的变化来检测线粒体膜电位的变化,来衡量线粒体去极化的比例。检测 .单聚体时把显微镜的激光设置,发射光设置为,检测 .聚合物时,把激发光设置为,发射光设置为.将激光共 聚焦显微镜所有条件,视野大小、部位,摄片的所有条件定位同一标准、 摄片。 .系统检测各组红色荧光量、绿色荧光量及比例。 ..用? . 活性的测定 ..实验分组 将对数生长期细胞按×的细胞密度种入培养瓶中,培养至约 %.%满时,弃培养液,每孔加入不含血清的培养液继续 培养,使细胞基本同步化于期后再进行分组。按下列分组每组 瓶进行处理: ?对照组.%血清培养液 ?不同时间去甲斑蝥素组.,/去甲斑蝥素、.%血清培养 液 ?..组./去甲斑蝥素、.%血清培养液、 ??。 ..提取蛋白 各组继续培养、、、后,吸取细胞培养液,备用。用胰 酶消化贴壁细胞,并收集至备用的细胞培养液中。、离心分钟 收集细胞,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,洗涤一 次。同前吸尽上清后,按照每万细胞加入裂解液的比例加入 裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解分钟;。、,.,离心分 钟,把上清转移到冰浴预冷的离心管中;立即测定.的酶活,按研究论文 一活性检测试剂盒提供的步骤操作。同时可以取少量考马斯亮蓝 .法测蛋白浓度。 ..测定标准曲线 按照每.检测缓冲液加入.裂解液的比例配成适量的标准品 稀释液;把试剂盒提供的用标准品稀释液稀释为、、、 、和,作为标准品;每个浓度取用酶标仪进行测量, 测出;每个标准品的减去不含的空白对照组的计 算出吸光度,做出浓度于的标准曲线。 .. 酶活性的测定 ...取出和适量的.,置于冰浴上备用。 ...如下设置反应体系 空白对照 样品 微升 检测缓冲液 微升 微升 微升 待测样品微升 微升总体积 微升 微升 ...加入.后混匀,注意避免在混匀时产生气泡。 ?孵育过夜。发现颜色变化比较明显时即可酶标仪测定。 ...样品的扣除空白对照的,即为样品中.催化 产生的产生的吸光度。通过同步获得的标准曲线的对比就可以计算 出样品中催化产生了多少量的。 ...参考公司的.酶活力单位的定义: . ?。即 . .. 一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在?可以剪切 产生 的.的酶量。这样就可以计算出样品中含 有多少个酶活力单位的.。 ...根据考马斯亮蓝.法测定的待测样品中的蛋白浓度可以计算 出一个样品单位重量蛋白中所含的.的酶活力单位。 .统计学处理 计量资料数据以均数?标准差?表示,利用.软件进行研究论文 统计分析,多组间均数差异比较采用单因素方差分析. 及检验,.,即认为有统计学意义。 结 果 去甲斑蝥素对增殖的影响:法检测细胞增殖显示,不同浓 度.叫、.州、.叫、.叫、.叫的去 甲斑蝥素分别作用、、与对照组相比值明显降低, 、. 士.、.士.、. .士.、.士. 土.与对照组 .士.相比,.;.士.、.士.、.土.、.士 .、.士.与对照组.土.相比,氏.;.士.、 .士.、.士.、.士.、.士.与对照组.土. 相比,.;总体均数差异有统计学意义,不同时间对活化的 肝星状细胞增殖有抑制作用,且存在一定的剂量与时间依赖性。抑制率同 样具有时间与剂量依赖性,开始抑制增殖抑制率由.%增高 至.%,抑制作用明显增强抑制率由.%增高至.%,而 。 组由.%增高至.%., 去甲斑蝥素对凋亡的影响。 ?普通电子显微镜及 染色荧光显微镜下检测细胞凋亡形 态显示:对照组细胞大小均匀,干预后,细胞核浓缩、凋亡 小体出现,说明可诱导活化的肝星状细胞凋亡,../作 %士.%、 .%士. %、 用、、细胞凋亡率. .%士.%升高,与空白对照组.%土.%相比有统计学差异 。 尸.醇..薛.,., ?流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率结果示:.州、./ 、.“‖干预后对细胞周期的影响显示:与对照组相比, /期细胞数所占比例逐渐增多.%士.%、.%.%、 ./社.% .%士.%,.,期细胞呈现下降的趋势 .扯.%、.. %、.%土.% . %士.%, 尸. ..;而细胞凋亡率./扯.%、.%士.%、 .%士.%随药物浓度升高逐渐增高,与对照组.%士.% 研究论文 相比,有显著的统计学差异尸.;当加入..后,细 组.%.%有 胞凋亡率.%士.%较./ 。 所下降...... ?.试剂盒流式细胞仪法检测细胞的早期凋亡线粒体膜电位改变结 组分别作用于 、、与阴性对照组 果示:./ 相比线粒体膜电位均降低..、..、..较 阴性对照组. .相比,均有统计学差异氏.,线粒 。同样条件下激光共聚焦显微镜下观察在 体膜电位最低.., 作用于,线粒体膜电位..与阴性对 ./ 照组. .、阳性对照组..相比均下降,且有统计 。 学差异尸...... ?活性检测显示:./的去甲斑蝥素作用活化的肝星状细 胞、 、、后,活性..、..、 .. 、.. 较对照组.. 相比明显升高,加入 ?.后.. 较去甲斑蝥素组有所下降, ,说明去甲斑蝥素可 活性差异有统计学意义尸..., 影响活性,作用时的活性开始升高,作用后 活性最高,而加入.?后可抑制去甲斑蝥素的活性 增高的作用。 研究论文 附 图 ../ ./ 兮薏. ./ . . ;一??, ../ /, .,. ~ ’ 十 二 . ‘ ”? 女 ?聋 ~ ‘ ?’。 。 : ,~ 嘉 ?。 ?, , , 。 廿 《;? ;? , , ‖。。誊 一 ?罗,“ ; ;。晒。囊寸 ’? ’ , ? ? 。 ~ 。、 ? 。’,, 一 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ,?。.一. ,,々研究论文 .... ... 一 ..?... . . 研究论文 ./ .. .. ./ ./ .. .. ? ? ※ 量。 :: 囱一扇 . . ? ? ..研究论文 季 童 芸 子 弓 . . .. . ..... ? ./一./ ... ... 宰. .. ,※. ?? ./...尸.,氏. / . 研究论文 。 爹 疆 尊 芝 ..,,,※. . 玑屠葺掌叠再暑旨皇鼍暑盒奄暑,皇 仉 仉 . ..、 、, 木 . ,孝. . 研究论文 一臀口?备苫鼍嘧雪? .. ./ 一 , . 孝. . ,社.?研究论文 附 表※.. .士. .土. .士. / .士. .士. . .士. / .士. .土. .士. ./ .士. .士. .士. ./ .士. .士. .士. ./ 研究论文 % .士...木.士.水.士. 牛 宰尸. .※. ? ./ 研究论文 .士. .士. ※. .※书..※孝.士. ※舞 ※尸.孝尸. 一 ’ 宰尸.撑. . . : : 研究论文 . . . : : .士. .土..士. ...士. .士.※ ? 尸.※尸. ?./ 研究论文 讨 论 肝脏纤维化是由多种因素引起的慢性疾病而引起的肝脏的一种损伤 性的修复反应,其主要特征即:胶原及致细胞外基质的过度沉积。肝脏纤 维化是慢性乙型肝炎、丙型病毒肝炎、血吸虫病等各种慢性肝病的共同的 病理表现,其也是肝硬化的前期表现。目前公认,肝星状细胞的活化是肝 脏纤维化形成的中心环节【,活化的肝星状细胞是细胞外基质的主要来 源,肝星状细胞由静息状态被激活后转化为肌成纤维细胞,并且合成型、 型胶原增多,并分泌.、.,抑制胶原的形成,引起肝脏结 构重建,肝脏纤维化的发生。然而,肝纤维化是可逆转的,且已被实验及 临床研究所证实。目前认为肝纤维化逆转并不是由活化状态转为静息状 态,而是通过促进肝星状细胞凋亡减少其数量来实现的【】。著名的肝脏病 专家教授【】指出:肝纤维化不仅可逆,而乙肝、丙肝及酒精性 肝病所致肝硬化可逆性也很好地被。因此,逆转肝纤维化可延缓病情 的进展,在可逆的肝脏纤维化阶段采取有效地抗纤维化治疗不失为有效的 办法。随着人们不断加深对肝脏纤维化的认识,许多抗肝脏纤维化的药物 已成为研究热点。目前针对抗肝纤维化的治疗主要如下:治疗原发病: 病毒性肝病即采取抗病毒治疗;抗肝脏纤维化:抑制肝星状细胞活化 并促进其凋亡,促进胶原基质的降解,研究证实抗氧化剂丹参酮一 】通过抑制活化,促进胶原降解;吡非尼酮可通过抑制成纤维细 胞增殖减少胶原基质的合成起到抗纤维化作用;血管紧张素一受体 拮抗剂可抑制活化与增殖达到抗肝脏纤维化的作用【】;卤呋酮抑制 型前胶原合成与表达能够有效防止肝纤维化的发生【】。而等】 同样证实诱导凋亡可减轻肝纤维化程度,因此诱导活化的凋 亡是抗肝纤维化的一种有效途径。在我国有多个中药复方合剂如复方 合剂【】、复方鳖甲软肝片【】等不仅实验性证实可诱导体外培养活化肝星 状细胞发生凋亡,而且被国家食品药品监督管理局批准上市,并经过多中 心、随机临床试验证实具有良好的抗肝纤维化效果,中药在我国抗肝纤维 化起着重要作用,我们应挖掘出更多的、有效的抗肝纤维化药物,并弄清 作用机制。 斑蝥是鞘赤目芫青科斑芫青研究论文 昆虫的俗称,斑蝥素 ,.氧杂二环【’,】庚烷一.烯一,二 甲酸酐,是一种半帖烯毒素,是斑蝥的有效成份;去甲斑蝥素 是斑蝥素的衍生物,由马来酸与呋喃按 .人工合成的【】。自年以来就用于抗肿瘤的研究, 其还具有抗炎、调节免疫、升高白细胞、抗组织纤维化的作用?,在临 床上用于治疗乙肝、肝硬化、肝癌、食管癌,并对乙型肝炎病毒复制有一 定的抑制作用。大量体外试验证明主要通过抑制细胞生长诱导 其凋亡来发挥作用,已证实去甲斑蝥素可以调控细胞凋亡途径,影响细胞 周期,从而诱导细胞凋亡、抑制其增殖【。目前发现去甲斑蝥素诱导肿 瘤细胞凋亡的信号转导途径与家族等密切相关。研究证实 可以延缓蛋白超负荷所致肾病大鼠肾脏纤维化【】,但其用于 肝脏纤维化的研究尚未见报道,是否能够抑制增殖、促进其 凋亡作用为此,开展了对增殖与凋亡的研究,本实验将不同浓度 的,干预体外培养的大鼠的肝星状细胞,通过观察该药物对 增殖、凋亡以及细胞周期的影响,对线粒体膜电位、酶活性的 影响,来进一步探讨是否具有抗肝脏纤维化作用以及可能的机制。 实验结果显示:应用法检测对增殖的影响:将不 同浓度的去甲斑蝥素分别作用于、、后,显示去甲斑蝥 素对的增殖有抑制作用,作用同一时间随着药物浓度的增加其对细 胞的抑制作用越强;相同浓度作用不同时间,随着时间的延长抑制作用越 强,由此我们得出结论,去甲斑蝥素能够抑制增殖,其抑制作用具 有一定的时间.剂量关系。国内外文献报道对,, ,,一等】细胞生长影响结果相一致。 研究证明抑制增殖、促进其凋亡,进而减少的数量,其为 抗肝纤维化的有效途径,肝星状细胞凋亡在抗肝脏纤维化过程中起着关键 作用,因此我们进一步来研究对肝星状细胞凋亡的的影响。 本实验应用荧光染色检测凋亡结果显示:荧光 显微镜下可观察到正常的细胞核大小均一,荧光染色均匀,干预组细胞核 的染色质的凝集、核的皱缩及凋亡小体等明显的细胞凋亡形态变化,当 作用于开始出现凋亡、后凋亡作用明显增强,作用细 胞凋亡率可明显升高;我们通过流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期,由结