[练习]细胞凝集反应

[练习]细胞凝集反应 【实验目的】 1. 了解细胞膜的表面结构 2. 掌握凝集素促使细胞凝集的原理 3. 学习研究细胞凝集反应的方法 【实验原理】 凝集素是一类含糖(少数例外)并能与糖转移结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。常用的为植物凝集素，通常一起被提取的植物命名，如伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是他们的总称。 在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被(又被称为糖萼)。凝集素能与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞凝集。凝集素引起的血细胞凝集，其细胞膜结构没有发生变化，与血液凝固中发生的复杂生物化学过程完全不同;另外，凝集素能与不同的糖蛋白特异结合，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集，但是凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，因此，Ponder提出应称“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。 人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。ABO血型鉴定主要用于临床输血，在皮肤、肾等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体;不孕症和新生儿溶血症病因的分析及亲子鉴定等。另外，凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面展示出了十分广阔的应用前景。如:植物凝集素可抑制受精;芸豆 -1反转录酶的活性，减少HIV感染者的病毒载量;细胞膜凝集素可直接抑制HIV 表面糖复合物的糖链结构与肿瘤细胞增殖、侵染、转移等发展过程密切相关，凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出癌症相关的糖链标志物。 下面介绍几种细胞凝集的反应技术: 一. 直接凝集反应技术 颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应的抗体血清混合后，在电解质 的参与下，经过一定时间，抗原抗体凝聚成肉眼可见的凝集块，这种现象称 为凝集反应。 血清中的抗体称为凝集素。抗原称为凝集原。 细菌或其他凝集原都带有相同的电荷(阴电荷)，在悬液中相互排斥而呈均 匀的分散状态。抗原与抗体相遇后，由于抗原和抗体分子表面存在着相互对 应的化学基团，因而发生特异性结合，称为抗原抗体复合物。由于抗体与抗 原结合，降低了抗原分子间的经典排斥力，抗原表面的亲水基团减少，由亲 水状态变为疏水状态，此时已有凝集的趋向，在电解质(如生理盐水)参与 下，由于例子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之是去 了彼此间的经典排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒。出现了 肉眼可见的凝集反应。 但是，直接凝集反应技术还有几个缺陷:特异性不高、抗原抗体无法获得或 无法用于实验。 二(间接凝集反应技术 可溶性抗原(或抗体)吸附雨免疫学反应无关的颗粒(称为载体)表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体(或抗原)相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。 载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。 间接凝集反应的优点为: 1. 敏感性强:间接凝集反应是最敏感型的血清学反应方法之一，可以检测到 微量的抗体和抗原; 2. 快速:一般1h-2h即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟; 3. 特异性强; 4. 使用方便、简单 三(载体 具有吸附抗原(或抗体)的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。 良好的载体有以下几点基本要求: 1. 在生理盐水或缓冲液无自凝倾向; 2. 大小均匀; 3. 比重与介质相似，短时间内不能沉淀; 4. 无化学或血清学活性 5. 吸附抗原(或抗体)后，不影响其活性。 目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。而后者应用更广，因为其 来源方便。另外绵羊红血球的表面有大量的(约1000个以上)糖蛋白受体， 极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。 【实验材料】 1. 材料 土豆块茎、韭菜叶片、家兔、抗人A血清、抗人B血清 2. 试剂 (1)PBS缓冲液 称取 NaCl7.2g、NaHPO1.48g、KHPO0.43g，加蒸馏水，24@$ 定容至1L，调pH至7.2。 (2)1%肝素溶液 0.1g肝素溶解于10mL0.9%氯化钠溶液中。 3. 器材 5mL注射器、酒精棉球、双凹片、载玻片、普通光学显微镜、托盘天平、滴 管、离心管。 【实验步骤】 1. 取土豆去皮块茎2支，加10mLPBS缓冲液，浸泡2小时，浸出的粗提液中即 含有可溶性土豆凝集素。 2. 抽取兔子静脉血(加抗凝剂)1mL，加生理盐水3mL，在1000r/min条件下， 离心5分钟，重复3次离心。最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2%红细 胞悬液。 3. 用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞悬液各一滴，置双凹片的左孔内，充分混 匀，静置10分钟后，显微镜下观察。 4. 同时以PBS缓冲液加2%红细胞悬液各一滴，置双凹片右孔作对照实验。 【实验结果】 1. 实验前后的宏观效果对比 开始: PBS缓冲液 土豆凝集素 开始时，从宏观上来看，加入PBS缓冲液和加入土豆凝集素的两滴细胞悬液差异不大，此时还未发生细胞凝集作用。 终了: 沙粒状物质 PBS缓冲液 土豆凝集素 结束时，对比已经比较明显，其中加入土豆凝集素的细胞悬液发生了细胞凝集现象，红细胞凝集在一起，形成了沙粒状的物质，周围的悬液较澄清。 2(显微镜下微观效果对比 PBS溶液:细胞呈常态，无明显变化。 土豆凝集素:很多细胞凝集在一起，形成了若干块的凝集后的产物，颜色较深。 【实验结果分析与注意事项】 1. 把液体滴加到双凹片上时，注意用量，防止过多的悬液溢出后，使两个细胞 悬液接触，则实验结果不可靠。 2. 用手晃动双凹片时，注意摇晃的姿势:一只手用手掌处贴紧双凹片，另一只 手抵住双凹片的另一侧上下晃动。 【思考题】 1. 哪些因素影响细胞凝集反应, 答: (1) 温度。温度影响酶的活性。 (2) 时间。随着时间的延长细胞聚集程度增大。 (3) 凝集素。不同的凝集素凝集程度不同。 (4) 反应底物。 (5) 细胞类型。 (6) 反应培养板的质量。 (7) 人为因素。 2. 结合凝集素的特性，简述凝集素在生物学中有何应用,研究凝集素有何意 义, 答:人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。ABO血型鉴定主要用于临床输血，在皮肤、肾等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体;不孕症和新生儿溶血症病因的分析及亲子鉴定等。另外，凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面展示出了十分广阔的应用前景。如:植物凝集素可抑制受精;芸豆凝集素可直接抑制HIV-1反转录酶的活性，减少HIV感染者的病毒载量;细胞膜表面糖复合物的糖链结构与肿瘤细胞增殖、侵染、转移等发展过程密切相关，凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出癌症相关的糖链标志物。