DNA与HBV-SM及肝功能分析相关性的临床回顾性研究

DNA与HBV-SM及肝功能分析相关性的临床回顾性研究 DNA与HBV-SM及肝功能分析相关性的临 床回顾性研究 1288 ? 论 重庆医学2007年7月第36卷第13期 血清HBV—DNA与HBV—SM及肝功能分析相关性的临床回顾性研究 吴丽娟,陈伟,蔡晋,夏季,张雪莹. (1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科,重庆400042;2.解放军第94923部队卫生所 福建武夷山354301;3.海军91126部队43分队,辽宁大连ll6041) 摘要:目的探讨血清HBV-DNA含量与HBV-SM的相关性以及HBV—DNA含量与肝功能之间的关系,揭示HBV—DNA 含量与临床乙型病毒性肝炎病变程度之间的内在规律,提高实验诊断信息的利用效率.方法采用回顾性调查法,HBV—DNA含 量采用适时荧光定量PCR测定,HBV—SM采用ELISA定性检查,肝功能采用全自动生化分析仪进行测定.结果HBV—DNA含 量与HBV—SM存在一定的内在联系,HBV—SMIHBV—DNA阳性率和含量最高,HBV—SM?阳性率和含量次之,两组病例中的绝 大多数HB,r-DNA在1O以上.其余各HBV—SM模式阳性病例HB,LDNA主要分布在1O以内.单项HBsAg(+),HBeAg (+),HBeAb(+)和HBcAb(+)HBV-DNA阳性率及绝时含量较高,顺序是HBeAg(+)>HBcAb(+)>HBeAb(+)>HBsAg (+),单项HBsAb(+)和HBV—SM(一)人群中仍然有<1O的人HBV—DNA阳性,其HBV—DNA一般在10以内.HBV-DNA 含量与血清总蛋白和白/球比值无关,与AST和ALT呈现单峰曲线关系,随着HBV—DNA含量的升高,AST和ALT活力在不同 程度上现为一个从低到高,再到低的过程.结论HBV—DNA与HBv_SM及血清 转氨酶之间存在相关性,HBv_DNA快速适 时荧光定量分析的临床应用价值在于传染性识别,极早期感染诊断和低水平感染 诊断,对慢性乙型病毒性肝炎的肝损害及病程判 断,疗效监测有一定的辅助价值,与ELISA联合使用可以达到取长补短的效果. 关键词:乙型肝炎病毒DNA;血清学标志物;肝功能 中图分类号:R512.62;R446.112文献标识码:A文章编号:1671— 8348(2007)13-1288-04 ClinicalretrospectiveinvestigationinrelationshipamongHBV.DNA.HBV.SMandhepaticfunctionanalysis WULi—juan,CHENW,CAjJin.eta1. (1.DepartmentofClinicalLaboratoryLab,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity, Chongqing400042,China;2.HealthService,94923Unit,PLA,Wuyishan,Fujian354301,China; 3.43thBranch,Navy91126Unit,PLA,Dalian,Liaoning116041,China) Abstract:0bjectiveToassesstheclinicalperformanceofreal— timePCRforthedetectionofhepatitisBvirus(HBV)DNAin thepatientswithchronicHBVinfectionandtoexploretherelationshipbetweenthequantitiesofHBVDNAandthemodelsofse— rologicmarkersandhepaticfunction.Torevea1theinterna11awbetweentheamountofHBv_DNAandthe1esiondegreeof1iverin clinicalpatientwithviralhepatitisB,andtoincreasetheusageefficientofclinicallaboratorydiagnosisinformation.MethodsReal_ timefluorescentquantitativePCRwasusedtomeasuretheHBVDNA.ELISAwasusedtodetecttheHBV—SM.Hepaticfunction wasdetectedbyanautomaticbiochemistryanalyzer.ResultsTherearesomeintra-correlationbetweentheamountofHBV—DNA andHBV-SM.ThepositiverateandtheamountofHBV-DNAofHBV-SMIpatternarethehig hestandHBV—SM?patternliesat second.MostpatientsinHBV— SMIpatternandIIpatternhavemorethan10HBVintheirperipheralblood.Inotherspatternsof HBV—SM,theamountofHBV— DNAischieflydistributedin10copies/m1.ThepositiveratesandtheamountofHBV— DNAof singleHBsAgpositivegroup.HBeAgpositivegroup,HBeAbpositivegroupandHBcAbpositivegroupsarehigherthansingle HBsAbpositivegroupandnegativegroup.TheamountofHBV— DNAisHBeAgpositivegroup~HBcAbpositivegroup~HBeAb positivegroup~HBsAgpositivegroup.AmongthepersonwithsingleHBsAbpositiveorHBV-SMnegative,thepositiverateof HBV—DNAis1essthan10,butthe1evelsofHBV— DNA DNAisbelow10.ThereisnocorrelationbetweentheamountofHBV— andthetotalproteinaswellastherateofalbuminandglobulin.Therearean-single-cusprelationshipsbetweentheamountof HBV—DNAandASTandALT.FollowtheheighteningoftheamountofHBV— DNA,thelevelsofASTandALTshowaprocess fromlowtohighandfromhightolowagain.ConclusionTherearecertainlyrelationshipsamongHBV—DNA,HBV—SMandserum transaminase.TheclinicalapplicationvalueofHBV-DNAquantitativeanalysisbyreal— timePCRisininfectivedifferentiation,ear lyinfectiondiagnosisandlow-level— infectiondiagnosisandhelptojudgethecourseandmonitorcurativeeffect.Aconjointuseof real—timePCRandELISAcanmakeupforeachothersdeficiencies. Keywords:HBVDNA;serologicmarkers;hepaticfunction 乙型肝炎病毒(HBV)病原学诊断是乙型病毒性肝炎诊断 的主要依据.目前临床上常见的诊断方法包括酶联免疫分析 法和基因诊断法,前者对HBV血清标志物(serologicmarkers ofhepatitisBvirus,HBV-SM)进行测定,后者如杂交,PCR技 术,适时荧光定量扩增技术等,是对HBV-DNA进行的直接检 测.适时荧光定量扩增技术克服了传统PCR技术特异性及假 阳性方面存在的不足,以其简便,快速,灵敏度高,特异性强的 优势在临床很快得到广泛应用.作者回顾性调查了本院检验 科2001年3月,2005年5月血清HBV-DNA适时荧光定量 分析报告,旨在明确适时荧光定量扩增技术定量分析血清样品 重庆医学2007年7月第36卷第13期 中的HBV—DNA在临床乙型病毒性肝炎诊疗中的应用价值, 提高实验诊断信息的利用效率. 1对象与方法 1.1对象与诊断2001年3月1日,2005年5月25日 本院门诊,住院患者及健康体检者2672人.年龄11,67岁, 男1781例,女891例.急慢性乙型肝炎诊断标准为2000年 中华医学会传染病与寄生虫学分会,肝病学分会联合制订的 "病毒性肝炎临床诊断标准".所有对象分别抽静脉血送检验 科免疫学检验室,基因诊断室,生化检验室独立检测.检测前 和检测过程中,临床医生,各检验室相关人员之间无信息沟通, 结果由第三者汇总统计. 1.2试剂与方法 1.2.1HBV—DNA分析采用Real—timePCR法,试剂盒由 中国深圳匹基生物股份有限公司提供,扩增仪为美国 BI()_RAD公司生产的IcyclerReal—timePCR扩增仪,检测方 法严格按照试剂盒说明书进行. 1.2.2HBV—SM检测包括HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBe— Ab和HBcAb5个项目.采用ELISA法,试剂盒由中国兰州 标佳生物技术有限公司提供,仪器为意大利AMP全自动酶免 分析仪,检测方法严格按照试剂盒说明书进行. 1.2.3肝功能检查包括总蛋白,清蛋白,丙氨酸氨基转移酶 (ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)5项,其中总蛋白采用双 缩脲法,清蛋白采用溴甲酚绿法,球蛋白一总蛋白一清蛋白, A/G为清蛋白与球蛋白的比值.AST和ALT采用速率法进 行测定.全部试剂采用美国Beckman公司原装配套试剂,以 Beckman公司CX7全自动生化分析仪进行测定. 1.2.4质控措施所有相关检验项目每天均进行质控跟踪, 质控物测定结果不符或超出警戒线必须重做.肝功能各项指 标质控物为Beckman公司提供的高,中,低3个水平质控品. HBV—SM中的HBsAg2ng/ml,HBeAg,HBcAb,HBeAb和 HBsAb各2IU.HBV-DNA阴阳性临界阳性质控品为5×10 拷贝/ml. 1289 1.3分组按照临床乙肝"两对半"常见检测结果出现方式, 将HBV—SM检测结果分为如下模式:I:HBsAg(+)/HBeAg (+)/HBcAb(+),即俗称"大三阳";?:HBsAg(+)/HBeAb (+)/HBcAb(+),即俗称"小三阳";?:HBsAg(+)/HBcAb (+);?:HBsAg(+);V:HBsAb(+)/HBeAb(+)/HBcAb (+),即俗称"三抗阳性";?:HBsAb(+)/HBeAb(+);?: HBsAb(+)/HBcAb(+);?:HBeAb(+)/HBcAb(+);?: HBeAb(+);X:HBcAb(+);?:HBsAb(+);?:HBV—SM (一),即全部"两对半"指标阴性.HBV-DNA定量结果以荧光 定量分析系统检出限为界线,HBV—DNA<1×1O拷贝/ml为 阴性,HBV-DNA?1×1O拷贝/ml为阳性,阳性结果按照反 映传染性强弱的HBV—DNA浓度进一步分为如下几组:A组: HBV—DNA?1×1O拷贝/ml;B组:HBV-DNA>1×1O拷 贝/ml,且?1×1O拷贝/ml;C组:HBV-DNA>1×1O拷贝/ ml,且?1×1O拷贝/ml;D组:HBV—DNA>1×1O拷贝/ml. 1.4统计学处理采用MicrosoftExcel2000进行统计运算, 以j?S表示,组间差异使用t检验. 2结果 2.1HBV—DNA定量与HBV—SM检测结果的比较4年期 间临床送验HBV-DNA定量分析的血液样品7208份,总阳性 率63.76,其中同时送验HBV—SM分析的血液样品2672 份,结果分别见表1,图1和图2.HBV—SM模式IHBV—DNA 总阳性率达97.98,阳性率B组>c组>D组>A组;HBV— SM模式?总阳性率5O.18,阳性率B组>A组>c组>D 组;其余各HBV-SM模式阳性率均是A组>B组,c组和D组 少有阳性出现.不同HBV的ELISA单项检测结果中,以 HBeAg(+)组,HBcAb(+)组,HBeAb(+)组和HBsAg(+) 组的HBV-DNA的阳性率较高,阳性率峰值均出现在B组,其 顺序是HBeAg(+)组>HBcAb(+)组>HBeAb(+)组>HB— sAg(+)组.HBsAb(+)组和HBV—SM(一)组的HBV—DNA 的阳性率低,其中A组>B组,c组和D组无HBV-DNA阳 性. 表12672例临床血液样品HBV—SM模式HBV—DNA定量结果 HBV—SM模式HBV—DNA阳性分组 nHBV—DNA阳性数()—— A组B组C组D组 IHBsAg(+)/HBeAg(+)/HBcAb(+) ?HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+) ?HBsAg(+)/HBcAb(+) ?HBsAg(+) VHBsAb(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+) ?HBsAb(+)/HBeAb(+) ?HBsAb(+)/HBcAb(+) ?HBeAb(+)/HBcAb(+) ?HBeAb(+) XHBcAb(+) ?HBsAb(+) ?HBV—SM(一) 729(97.98) 551(50.18) 181(64.64) 15(57.69) 10(90.91) 11(39.29) O 13(19.40) 5(100) O 9(3.50) 12(8.45) HBV-SM模式中(+)表示该项目阳性,(一)表示该项目阴性 娼73OOOOOOOOO 1221OOOOOOOO勰3 456213O5OO23们6 ?盯?98O85O79 48O618875672?勰226H 129O 表2HBV—DNA与肝功能检查结果之间的关系 重庆医学2007年7月第36卷第13期 与阴性组相比,:P<O.05,一:P<O.01. l00 — 75 辟 甚50 盏 口 璺25 I II III ? V ? ? ? ? ? 逝啦魄D组 图1不同HBV-SM模式HBV-DNA阳性率比较 6O 5O 40 30 2O l0 O ^自宦噶c组嘲 图2各HBVELISA单项结果HBV—DNA阳性率比较 220 170 120 t\ 藿020 —?-^ST—?_^LT 03.1185.27.189.09 IoglO(HBV-DI~0 图3HBV—DNA含量与AST,ALT结果之间的关系 2.2HBV-DNA定量与肝功能检测结果的比较1023例样 品在送验HBV—DNA定量的同时送验了肝功能检查(结果见 表2).HBV-DNA含量与总蛋白和A/G比值之间均无相关 性(r一0.000O),HBV—DNA含量与AST和ALT之间相关性 系数r分别为0.5034和0.6331,二者之间呈现图3所示的单 峰曲线. 3讨论 适时荧光定量PCR用于血清HBV—DNA的定量分析,方 法学线性范围在1×10,1×10,批内变异系数<6,批 间变异系数在5,16之间],从方法学上讲是一种精度 高且线性范围广的优质实验诊断技术.Jardi等发现 HBeAg(+)且伴有ALT持续高水平患者的HBV—DNA含量 达9.2×10.拷贝/ml,HBeAb(+)且伴有ALT持续高水平患 者的HBv_DNA含量达1.3×10拷贝/ml,HBeAb(+)且伴 有ALT波动患者的HBV-DNA含量达3.7×1O拷贝/ml,无 症状携带者HBV-DNA含量在1O水平,上述各组患者血清 HBV-DN『A之间差异有统计学意义(P<0.05).杨旭等Is]报 道HBsAg(+)/HBeAg(+)的慢性乙型病毒性肝炎患者中, 87.3的病例其HBV—DNA含量在1O.水平之上,66.7的病 例其HBV-DNA含量在1O水平之上;HBsAg(一)的慢性乙 型病毒性肝炎患者中,74.5的病例其HBV—DNA含量在1O. 水平之上,8.3的病例其HBV-DNA含量在1O水平之上. HBeAg(+)的慢性乙型病毒性肝炎患者其HBV—DNA含量高 于HBeAg(一)的患者(P<0.01),HBeAb(一)的慢性乙型病 毒性肝炎患者其HBV-DNA含量高于HBeAb(+)的患者(P <0.01),HBsAg(一)人群中也有部分HBV-DNA阳性.作 者发现1例其HBV—DNA水平甚至高达1.5×10.水平,推测 该例患者存在HBV免疫耐受或严重抗感染免疫低下的情况. 总之,作者回顾性调查结果与上述文献报道结果基本一致. 作者以HBV-SM临床常见阳性结果呈现的多种模式进行 观察,发现:(1)HBV-SM模式?,?,V,?,?,?,?,? HBV—DNA阳性率与HBV-DNA含量呈反比关系,且HBV在 患者外周血中以低浓度存在为主,只有少数病例可以达到中浓 度水平.HBV—SM模式I和?外周血HBV阳性率与浓度水 平呈单峰曲线关系,且模式I阳性率和HBV-DNA浓度均明 显高于模式?,提示大,小三阳患者其外周血中的HBV主要 以中高浓度水平出现,大三阳人群血液HBV-DNA阳性率和 浓度水平高于小三阳人群,该结果与现有认识基本一致.(2) 小三阳传染性的传统认识存在误区.一般将小三阳且肝功能 正常人群视为无传染性或传染性低的健康人群,但是我们调查 结果表明一半以上的小三阳人群其外周血HBV—DNA阳性, 且以中高浓度水平为主,少数人(1.2)甚至可以达到每毫升 血1O.拷贝以上的超高浓度水平,小三阳合并肝功能异常者只 有3.1,说明小三阳人群中有一半以上具有较强或强的传染 性,个别人具有超强传染性,因此小三阳是否具有传染性和传 染性的高低必需补充HBV-DNA定量分析才能断定.该结果 与现有认识存在差距.(3)要重视HBeAb单独阳性(模式?) 和"三抗阳性"(模式V)的情况,这类患者绝大多数具有较低传 染性,机体处于乙肝的恢复阶段,并非假阳性.(4)要认真对待 HBsAb单独阳性(模式?)和"全阴性"(模式?)的情况,即两 一邑碍?譬羞_^璺 重庆医学2007年7月第36卷第13期 对半结果认为没问题的人群,其中模式?HBV—DNA阳性可 能与ElISA方法学灵敏度低或患者存在免疫耐受有关,而 模式?HBV-DNA阳性者反映其血清HBsAb含量的吸光度 值均略高于检出限,推测存在急性感染,机体自动清除病毒可 能性大.上述情况的阳性者一般HBV—DNA浓度较低,传染 性弱.(5)HBsAg,HBeAg,HBeAb,HBcAb单项阳性时HBV— DNA阳性率及绝对含量都较高,其阳性率高低顺序是HBeAg (+)>HBcAb(+)>HBeAb(+)>HBsAg(+);上述4项指 DNA阳性率和DNA绝对含量之间的关系呈现一个 标HBV— 单峰曲线且峰值出现的位置一致,说明它们阳性时传染性一 致.(6)HBV—DNA含量与总蛋白水平和白/球比值无关,与文 献报道一致;与文献报道不同的是,发现HBV—DNA含量与 AST和ALT存在关联,该结果与HBV—DNA阳性分组标准有 关,本研究采用1O分组,而其他文献多采用1O分组.致使统 计结果未能提炼出有效信息.因此,HBV—DNA含量与肝损害 程度之间是存在内在联系的.随着HBv-DNA浓度对数值的 升高,AST和ALT从低水平逐渐升高,在HBV-DNA浓度处 于中等水平时达到高峰,之后再度下降并保持在一个较高水平 上.其中ALT峰值水平是AST的3倍,即ALT曲线更能较 好地体现这种变化.提示临床应当以动态方式看待血液 HBV—DNA水平的变化,少量HBV感染人体后,经过血液系 统达到肝脏,感染肝细胞并在肝细胞中大量繁殖,导致肝细胞 破坏.释放出病毒继续感染临近的肝细胞,此时进入血液循环 的病毒数量一次次地增加,同时ALT,AST也因细胞破裂的 逐步增多而释放入血增加.当肝脏肝细胞损伤到一定规模后. 由于可以继续被破坏的肝细胞数目上的限制.新被释放入血的 病毒和胞内酶不再进一步增加,并伴肝细胞的耗竭开始下降. 总之.HBV-DNA适时荧光定量分析最突出的特点就是高 灵敏度和高特异性,可以检出血液中微量存在的Dane颗粒,对 1291 于HBV极早期,低水平感染的诊断,传染性的判断都是十分 良好的指标,对慢性乙型病毒性肝炎的肝脏损害程度,病程判 断,疗效监测有一定的辅助价值.但是.如果少量HBV潜伏 在肝细胞内没有窜到血液中,该法就不能捕捉到HBV,此时免 疫学诊断指标可以阳性,因此与ELISA联合使用可以达到取 长补短的效果. 参考文献: [1] [2] [31 [41 [5] [6] KesslerHH.Comparisonofcurrentlyavailableassaysfor detectionofhepatitisBvirusDNAintheroutinediagnos— tielaboratory[J].ExpertRevMolDiagn,2005,5(4): 531. 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