产3-羟基丙酸重组大肠杆菌发酵条件的响应面法优化 精灵论文

产3-羟基丙酸重组大肠杆菌发酵条件的响应面法优化 精灵论文 产 3-羟基丙酸重组大肠杆菌发酵条件的 响应面法优化 张晓梅 (江南大学医药学院，江苏 无锡 214122) 摘要:首次将响应面法 应用于产 3-羟基丙酸重组大肠杆菌 JM109 (pEtac-dhaB-aldh)发酵条 件优化,初步发酵试验 膏浓度, 维生素 B浓研究明影响 3-羟基丙酸产量的四个主要因子是初始甘油浓度, 酵母 12 度以及 KHPO,然后用中心组合设计及响应面确定主要影响因子的 最佳浓度。优化后培24 养基组成(g/L): 甘油 62 g/L、VB12 0.05 g/L、KHPO7.4 g/L 及酵母 24 膏 6.2 g/L，在此培 养基中 3-羟基丙酸的最大产量为 5.8 g/L。 关键词:3-羟基丙酸;响应面法;优化;重组大肠杆菌 中图分类号:Q81 Optimization for the Recombinant Escherichia coli Capable of Producing 3- hydroxypropionic acid using Response Surface Methodology Zhang Xiaomei (School of Medicine and Pharmaceutics, Jiangnan University, JiangSu WuXi 214122) Abstract: The response surface method (RSM) was firstly applied to determine and optimize the fermentation condition for the novel recombinant Escherichia coli JM109 (pEtac-dhaB-aldh) capable of producing 3-hydroxypropionic acid. A mathematical model was then developed to show the effect of each medium composition and their interactions on the production of 3-hydroxypropionic acid. The model estimated that, a maximal yield of 3-hydroxypropionic acid (5.4 g/l) could be obtained when the concentrations of glycerol, VB, yeast extract KHPOwere set at 62 g/L, 0.05 g/L, 6.2 g/L and 7.4 1224 g/L, respectively; These predicted values were also verified by validation experiments. Compared with the values obtained by other runs in the experimental design.The yield and productivity under the optimal parameters and process can reach 5.8 g/L. Keywords:3-Hydroxypropionic acid (3-HP); Response Surface Methodology; Optimization; Recom binant Escherichia coli 0 引言 3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，简称 3-HP)，又名 β-羟基丙酸，是一种较为活 泼的化合物，是诸多化合物合成的中间体，还可以用于生产涂料、胶黏剂、水处理化学品和 [1,2]个人护理用品，所以 3-羟基丙酸是非常重要的三碳平台化合物 。目前主要采用化学合成 法生产 3-HP，然而化学合成法生产 3-HP 的产品分离纯化较复杂，生产成本相应较高，生产 难度较大。与化学法相比，微生物发酵法具有成本低、操作简单、条件温和、副产物少、绿 色环保等优点。但目前尚未发现直接利用糖或其他有机原料产 3-羟基丙酸的微生物，因此， 利用基因工程菌转化甘油生产 3-羟基丙酸备受国内外研究者青睐，被认为是今后的发展方 向。 响应面法 (Response surface methodology ,RSM) 是统计技术的合称,它包括实验设计、 建模、因子效应评估以及寻求因子最佳操作条件。随着计算方法的完善和微机应用的普及, [3,4]近些年来响应面方法已成功地应用于生物技术的许多方面, 但用于优化产 3-羟基丙酸重 基金项目:教育部博士点新教师基金 (No. 20070295011) 作者简介:张晓梅，女，博士. E-mail: hanqiaowu@sina.com 组菌发酵条件方面尚未见文献报道。 本研究首次利用响应面法对重组大肠杆菌 JM109 (pEtac-dhaB-adlh)转化甘油的发酵进 行优化，并得到最佳发酵条件,为微生物发酵法生产 3-羟基丙酸奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 材料与培养方法 重组大肠杆菌 JM109 (pEtac-dhaB-aldh)，由本研究室构建。它是在大肠杆菌 JM109 的 [5]细胞中同时引入甘油脱水酶基因 dhaB 和乙醛脱氢酶基因 adlh 而构建的基因工程菌。 种子培养基为 LB 培养基。 [6]发酵培养基(g/L): (NH)SO2.0，MgSO?7HO 0.2，FeSO?7HO 0.005，CaCl0.1， 4424 2422 甘油、酵母膏、KHPO及维生素 B的浓度依实验而定。用 2 mol/L KOH 调 pH 值 7.0。 24 12 121 ?灭菌 15 min，必要时接种前加入卡那霉素至 50 μg/mL。 mL 三角瓶装 25 mL 发酵培养基，接种比例为 2 %(体积比)，37 ?， 摇瓶培养使用 250 150 r/min 旋转式摇床。根据实验方案改变培养基及培养条件进行发酵条件试验。 1.2 测定方法 3-HP 含量的检测:采用高效液相色谱法，色谱柱 Diamonsal C(5 μm,250 mm×4.6 mm); 18 流动相:甲醇:水=5:95，加入 HPO至 0.05%;紫外检测器。 34 甘油含量的检测:采用高效液相色谱法。色谱柱:ZORBAX NH(5 μm,250 mm×4.6 mm); 2 流动相:乙腈和水=70:30;流速为 1 mL/min;示差检测器。 生物量的测定:取适量发酵液用无菌生理盐水稀释至一定浓度后，于 600 nm 测定吸光 度(OD 值)。 2 结果与讨论 2.1 响应面分析( RSA)试验设计 预试验结果(数据未列出)表明 3-羟基丙酸的含量主要取决于底物甘油的浓度, 甘油脱 水酶辅酶 VB的浓度，KHPO及氮源酵母膏的浓度 4 个因素, 分别记为变量 X 、X 、X 、 12 24 123X 。以 3-羟基丙酸(g/L) 作为响应值, 记为变量 Y。根据 Box-Behnken 的中心组成设计原 4[ 7-9 ]理,设计了四因素三水平的响应面分析(RSA) 试验,共有 27 个试验点,试验因素与水平的 选取见表 1。本实验用统计分析软件 Stat-Ease/Design-Expert6. 12 对实验结果进行分析。 表1 因素与水平表 Tab. 1 Maximum and minimum levels of variables used in central composite design Concentration of variables (coded values) Variables -1 0 1 Glycerol (X) 1 5 9 1VB(X) 0 0.05 0.1 12 2KHPO(X) 3 6 9 24 3Yeast extract (X) 1 5 9 4 通过二次回归的旋转中心结合设计,对这 4 个显著因素进行寻优,以 3-羟基丙酸的产量为响应值,对应于因变量 Y 。运行 SAS 软件得到实验设计表及实验结果如表 2 所示。 表2 响应面设计表及实验结果 Tab. 2 Box-Behnken experiments design matrix with experimental and predicted values of 3-HP productivity Trial Y Variable s number 3-HP XX X X21 4 3 (Glycerol) (VB) Experimental Predicted (KHPO)(Yeast 12 24 extract) 1 -1 -1 0 0 0.10 2 -1 1 0 0 0.07 3 1 -1 0 0 2.20 4 1 1 0 0 2.91 5 0 0 -1 -1 2.81 0 6 0-1 1 2.93 7 0 0 1 -1 3.13 8 0 0 1 1 4.31 9 -1 0 0 -1 0.25 10 -1 0 0 1 0.11 11 1 0 0 -1 2.47 12 1 0 0 1 2.63 13 0 -1 -1 0 2.27 14 0 -1 1 0 3.25 15 0 1 -1 0 3.40 16 0 1 1 0 2.83 17 -1 0 -1 0 0.09 18 -1 0 1 0 0.29 19 1 0 -1 0 2.24 20 1 0 1 0 3.05 21 0 -1 0 -1 2.71 22 0 -1 0 1 3.1 23 0 1 0 -1 2.5 24 0 1 0 1 2.97 25 0 0 0 0 4.11 26 0 0 0 0 4.09 27 0 0 0 0 4.15 SAS 分析所得到的拟合全变量二次回归方程各变量的偏回归系数估计值及方差分析结 果见表 3 及表 4。 表3方差分析表 Tab.3 Analysis of variance (ANOVA) for the Response of 3-HP production Source Degree of Sum of squares Mean F-value P>F freedom square Linear 4 19.01 - 74.58 <0.001 Quadratic 4 26.58 - 104.26 <0.001 Crossproduct 6 1.13 - 2.96 0.0518 Total model 14 46.72 - 52.36 <0.001 Total error 12 0.76 0.064 - 2a Coefficient of variation (CV) = 10.4929; determination coefficient (R)= 0.9839; 表4 回归方程偏回归系数的估计值 Tab. 4 The least-square fit and parameters (significant of regression coefficient) StandardDegree of t value P>?t? Estimate Model term Error freedom Intercept 1 4.116667 0.145753 28.24 <0.0001* X1 1.215000 0.072877 16.67 <0.0001* 1 X1 0.086667 0.072877 1.19 0.2574 2 X1 0.260000 0.072877 3.57 0.0039* 3 X1 0.181667 0.072877 2.49 0.0283* 4 2X1 -2.200417 0.109315 -20.13 <0.0001* 1 XX1 0.182500 0.126226 1.45 0.1738 12 2X1 -0.712917 0.109315 -6.52 <0.0001* 2 XX1 0.152500 0.126226 1.21 0.2503 13 XX1 -0.387500 0.126226 -3.07 0.0097* 23 2 1 -0.425417 0.109315 -3.89 0.0021* X 3 XX1 0.075000 0.126226 0.59 0.5634 14 XX1 0.020000 0.126226 0.16 0.8767 24 XX1 0.265000 0.126226 2.10 0.0576 34 2X1 -0.510417 0.109315 -4.67 0.0005* 4 z Significant at 5% level (P<0.05) 2222 X, X,X,X 的 P 值均小当显著性检验 P<0.05 时，经 SAS 分析 X, X, X, X, X 23 342 13 4 1 于 0.05(表 4 中带有*标记), 因此全变量二次回归方程为: 22-0.71* X Y=4.91+1.215* X+0.26* X+ 0.181*X4 -2.2* X -0.388 XX-0.425 13 23 1 2 2 2X-0.510*X 3 4 对全变量的二次回归模型进行规范分析,考察所拟合的相应曲面形状。获得的响应面立体图如图 1,6 所示。 Fixed levers: KHPO=0 YE=0 Fixed levers: KHPO=0 YE=0 2424 图 1 甘油与 VB对重组菌产 3-羟基丙酸影响的等高线图及响应面图 12 Fig. 1Contour plot and surface plot of the combined effects of glycerol and VBon 3-HP by E. coli JM109 12 (pEtac-dhaB-adlh) 图 1 显示了 KHPO及酵母膏位于中心水平，即 6 g/L 和 5 g/L 时，甘油与 VB对重组 24 12 菌产 3-羟基丙酸性能的等高线图及响应面图，从图 1 可以看出，当维持 VB的浓度在一定 12 范围内，3-羟基丙酸的产量随着甘油浓度的升高而增加，但到一定水平时，3-羟基丙酸的产 量随着甘油浓度的升高反而下降，当甘油浓度在 0.2,0.6(58,74 g/L)，VB在-0.6,0.6 12 (0.02,0.07 g/L)范围内，3-羟基丙酸的产量大于 4 g/L。 Fixed levers: VB=0 YE=0 Fixed levers: VB=0 YE=0 12 12图 2 甘油与 KHPO对重组菌产 3-羟基丙酸影响的等高线图及响应面图 24 Fig.2 Contour plot and surface plot of the combined effects of glycerol and KHPOon 3-HP by E. coli JM109 24 (pEtac-dhaB-adlh) 图 2 显示了甘油与 KHPO对重组菌产 3-羟基丙酸性能的交互影响效应，等高线的形状 24 能反映出交互效应的强弱的大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形与之相反，从 图中可以看出，当 KHPO在一定范围内, 3-羟基丙酸的产量随着甘油浓度的升高而增加， 24 当甘油浓度在 0.2,0.6(58,74 g/L), KHPO在-0.6,0.9(4.2,8.7 g/L)范围内，3-羟基 24 丙酸的产量大于 4.8 g/L。 Fixed levers: KHPO=0 VB=0 Fixed levers: KHPO=0 VB=0 24122412 3 甘油与酵母膏]对重组菌产 3-羟基丙酸的影响等高线图及响应面图 图 Fig.3 Contour plot and surface plot of the combined effects of glycerol and yeast extract on 3-HP by E. coli JM109 (pEtac-dhaB-adlh) 图 3 显示了甘油与酵母膏对重组菌产 3-羟基丙酸性能的交互影响效应，从图中可以看 出，当酵母膏在一定范围内，3-羟基丙酸的产量随着甘油浓度的升高而增加，当甘油浓度在 0.2,0.6(58,74 g/L)，酵母膏在-0.6,0.8(2.6,8.2 g/L)范围内，3-羟基丙酸的产量大于 4.4g/L。 Fixed levers: GLYCEROL=0 YE=0 Fixed levers: GLYCEROL=0 YE=0 图 4 VB与 KHPO对重组菌产 3-羟基丙酸影响的等高线图及响应面图 12 24 Fig.4 Contour plot and surface plot of the combined effects of VBand KHPOon 3-HP by E. coli JM109 12 24 (pEtac-dhaB-adlh) 图 4 显示了 VB与 KHPO对重组菌产 3-羟基丙酸性能的交互影响效应，从图 4 的等 12 24 高线图可以直观的看出两因素的交互作用较为显著，同样从表 4 对回归方程的显著性检验得 到 VB与 KHPO交互作用显著(P=0.0097<0.05)。从图 4 还可以看出，当 KHPO在一 12 24 24 定范围内，3-羟基丙酸的产量随着 VB的升高而增加，维持发酵培养基中足够高的 VB浓 12 12 度，对于保证 3-羟基丙酸产量是必需的。当 VB浓度在-0.6,0.5(0.02,0.075 g/L)，KHPO12 24 在-0.4,0.9(4.8,8.7 g/L)范围内，3-羟基丙酸的产量大于 3.9 g/L。 Fixed levers: KHPO=0 GLYCEROL=0 Fixed levers: KHPO=0 GLYCEROL=0 2424 5 VB图与酵母膏对重组菌产 3-羟基丙酸影响的等高线图及响应面图 12 Fig. 5 Contour plot and surface plot of the combined effects of VBand yeast extract on 3-HP by E. coli 12 JM109(pEtac-dhaB-adlh) 图 5 显示了 VB与酵母膏对重组菌产 3-羟基丙酸性能的交互影响效应，从图 5 可以看 12 出， VB与酵母膏的交互作用不明显，当 VB浓度在-0.4,0.5(0.03,0.075 g/L)，酵母 12 12 膏在 0.3,0.6(6.2,7.4 g/L)范围时，3-羟基丙酸的产量大于 3.9 g/L。 图 6 显示了 KHPO与酵母膏对重组菌产 3-羟基丙酸性能的交互影响效应，从图 6 可以 24 看出，当酵母膏浓度在-0.4,0.7(4.84,5.8 g/L), KHPO在-0.3,0.8(4.8,8.4 g/L)范围 24 时，3-羟基丙酸的产量大于 4.8 g/L。对模型方程进行典型性分析说明，模型具有稳定点，稳 定点为其最大值。培养基最优组成为:甘油 61.8 g/L、VB12 0.049 g/L、KH2PO4 7.41 g/L 及 酵母膏 6.2 g/L，在此培养基中 3-羟基丙酸产量的最大估计值为 5.4g/L。 Fixed levers: GLYCEROL=0 VB=0 Fixed levers: GLYCEROL=0 VB=0 1212 图 6 KHPO与酵母膏对重组菌产 3-羟基丙酸影响的等高线图及响应面图 24 Fig.6Contour plot and surface plot of the combined effects of KHPOand yeast extract on 3-HP by E. coli 24 JM109(pEtac-dhaB-adlh) 2.2 模型验证 以响应面试验优化得到的培养条件进行 3 次发酵试验,得到发酵液中 3-羟基丙酸的浓度 分别为 5.2 g/L ,5.8 g/L,5.3 g/L 与模型计算值 5.4 g/L 相近似，预测值与实验值之间的良好拟 合性证实了模型的有效性及存在着极大值点，证明响应面方法对培养基优化确实非常有效。 3 结论 首次将响应面法应用于产 3-羟基丙酸重组菌发酵条件优化，实验证明响应面方法对培 养基优化是非常有效的工具。中心组合实验能快速地对主要影响因素进行优化,找出最佳值。 经响应面方法优化的最佳培养基配方组成为(g/L)甘油 62，维生素 B0.05, 酵母膏 6.2, 12 KHPO7.4。在此优化的培养基中, 发酵液中 3-羟基丙酸的终浓度可达到 5.8 g/L。 24 [参考文献] (References) [1] 张鸿达,刘成, 高卫华.等.微生物发酵法生产 3-羟基丙酸的研究进展[J].化工进展 2007,26(1):33,37 [2] Carole TM, Pellegrino J, Paster MD. 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