外周神经损伤后许旺细胞激活巨噬细胞的实验研究

外周神经损伤后许旺细胞激活巨噬细胞的实验研究 外周神经损伤后许旺细胞激活巨噬细胞的 实验研究 ? 192?华显微外科杂志2O02年8月第鲞筮塑 外周神经损伤后许旺细胞激活巨噬细胞的实验研究 黄涛秦建强刘大庸霍霄鲲余磊熊绍虎钟世镇 【摘要】目的研究外周神经损伤后,许旺细胞在激活巨噬细胞过程中的作用.方法以白介 素一lf3(I~lf3)的分泌量为巨噬细胞活性指标,用sD乳鼠制备预损伤神经及未损伤神经许旺 细胞条件培 养基,分别施加与纯化培养的SD大鼠腹腔巨噬细胞作用8h,FJ~SA法检测细胞上清液中白 介素一1含 量.结果预损伤神经许旺细胞条件培养基较未损伤许旺细胞条件培养基明显促进巨噬细胞 分泌 白介素.1艮结论外周神经损伤后,许旺细胞可通过分泌细胞因子来激活巨噬细胞. 【关键词】巨噬细胞;许旺细胞;白介素一1;外周神经 E.vl~rimeatalstIldyOil山eroleofSdlwlinn~dlsinm粼呷h}esaefivalion船pe—pIle嘲nerveinjury HUANGTao,QINJianqiang,LIUDayong,eta1.1nstiaaeofClinicalAnatomy,theFirst删 MedicalUniver- say,G凹u,510515Ch/na 【Al】st均ct】 ObjectiveTostudytheroleofSehwanncellsinmacrophagesactivationafterperipheralnerve injury.Mettm~Inthisstudy,the~lfetionofinterleukin-1/3(IL-113)asanactivationindexofmacmphage swas employed.TwokindsofinfantratSehwanncells(whichhadconl~fromintacandinjurednervesrespectiv ely)condi— tionednlediaweretreatedOilpurifiedculturedmacrophagesfor8hours.thenmeasuredthetL-113conte ntsinthecul— turedf瑾 IcmpIsuspensionmabyanenzyme-linkedimmunoadsordentassay(ELISA).ResultsThecondi— tionednlo~aofSchwanncellsconl~frominjuredllel-v~enhancedIL-113secretinginmacrophagesmor eobviously thanthatconl~fromintacllel-v~.ConclusionsAfterperipheralnerveinjury,Schwanncellscallactivate macrophagesbysecretingcertaincytokines. 【Keywards】Macmphage;Schwanncell;Interleukin-1~;Peripheralnerve 外周神经损伤后,损伤处和远侧段发生瓦勒变性, 轴索和髓鞘破裂成碎片,继之巨噬细胞大量聚集并被 激活.吞噬溃变碎片,通过分泌细胞因子等方式直接, 间接地促进再生_】J.巨噬细胞的聚集和激活也被认为 是外周神经损伤后能够得以再生的重要原因_2J.究竟 哪些因素参与调节了巨噬细胞的聚集激活过程目前尚 未明了,本研究以白介素一l8(IL-lf1)分泌量为巨噬细胞 活性指标,施加不同状态下的许旺细胞条件培养基来 模拟在体实验条件,培养巨噬细胞,用ELISA法对培养 液上清中的m-l13含量进行测定,以期阐明许旺细胞 在激活巨噬细胞过程中的作用. 材料和方法 一 ,许旺细胞条件培养基的制备 取3d大的sD乳鼠,乙醚麻醉后,无菌条件下,预 损伤一侧臂丛及坐骨神经(切断),缝合皮肤,继续喂 养,3d后引颈处死,浸入75%酒精5S,置于无菌手术 台,分别取其预损伤(损伤远端),未损伤侧神经,显微 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970833) 作者单位:510515广州市.第一军医大学临床解剖学研究所 ? 基础研究? 镜下仔细剥除神经外膜,充分剪碎,0.125%胰蛋白酶 消化7min,胶原酶消化20min,1000r/min离心10 min,加不含血清的DMEM/F12培养基(Signm公司,美 国),混匀后置于已涂鼠尾胶的培养瓶中差速贴壁20 min除去成纤维细胞,吸取培养基于离心管,1000r/ min离心7min,加不含血清的DMEM/F12培养基,调 整细胞浓度至2×105/ml,接种,置5%C0,培养箱 HeraeusHeracell,德国)中培养,细胞贴壁后可用S_ 100蛋白单抗通过免疫组化进行鉴定,许旺细胞纯度 高达95%以上,连续培养72h,收取培养液,1500r/ min离心10min,取上清,即为预损伤神经许旺细胞条 件培养基(CMSCinj.conditionedmediaofSehwann cellswhichco?lefrominjur~nerves)及未损伤神经许旺 细胞条件培养基(CMSCint,Theconditionedmediaof Sehwanncellswhichconlefromintacnerves).一20?冷藏 备用. 二,巨噬细胞上清液样品的制备 取1月龄sD大鼠,引颈处死,浸入75%酒精5s. 取出后置于手术台,逐层切开腹壁至腹膜,75%酒精棉 球擦洗2遍,注射器注入10m1的D—hank,液于腹腔中, : ___… 中华显微外科杂志2O02年8月第25卷第3期ChinJ喁’Al,,ol箜N0: 5min后吸取液体注入离心管中,1000r/rain离心7 rain,去上清,加不含血清的DMEM/F12培养基,混匀, 调整细胞浓度至1.2×106/ml,接种入24孔板.每孔 加0.5?d,2h后去除培养液,D.hank液冲洗2次,以加 不含血清的DMEM/F12培养基为对照组,实验组中加 入2种许旺细胞条件培养基,每组10孔,每孔液体总 量为500肚l,置5%co2培养箱中培养8h后,取培养 液,1500r/min,离心10min,将上清分别装入500无 菌塑料管中.一20?冷藏待测. 三,上清液中?,18含量的ELISA检测 本研究应用检测大鼠IL-I~ELISA试剂盒,按照试 剂盒说明操作,在ELISA检测仪上,于450nin波长处 检测各孔吸光度(A,旧称光密度OD),根据曲线 求出各浓度值. 结果 2种许旺细胞条件培养基施加与巨噬细胞作用8 h后,均可引起IL-I~分泌量的增加(1). 表1sD大鼠巨噬细胞IL-I~EIJSA测定结果(互?s) 注:各组浓度值均数两两比较(Student.Newman—keuls法)P<O.05 讨论 激活的巨噬细胞能够合成释放IL-1a,n,-t~,IFN—a 及TNF—a等多种细胞因子,外周神经损伤后,n,-t~可 刺激许旺细胞等非神经元细胞分泌神经生长因子,促 进神经再生J.因此,本研究选取IL-I~含量为巨噬 细胞活性指标,观察许旺细胞对其活性的影响. CMSCinj及CMSCint均能引起巨噬细胞分泌n,-t~ 增加,说明许旺细胞培养液中含有促进巨噬细胞分泌 ?,1B的因子,其中CMSCinj的作用远较CMSCim明显, 说明外周神经损伤后,许旺细胞分泌的促n,-t~分泌 因子量更多,生物活性更高或分泌新的促IL-I~分泌 因子. 外周神经损伤后,损伤处远侧段发生瓦勒变性,轴 索和髓鞘溃变,而许旺细胞却无类似变化,相反还大量 增殖并出现一过性的早期基因表达[4_6].这些基因表 达的时相多数与损伤后巨噬细胞要经过2,3d延迟 再大量聚集这一特征不符,因此,许旺细胞分泌物在巨 噬细胞聚集及激活中的作用易为人们所忽视.Carroll 等『J研究发现,外周神经损伤后1.5h,在损伤处就有 ? 193? 细胞表达单核细胞趋化蛋白一lmRNA(rnRNAJE),至16 h,整个远侧段的神经内膜中均可见rnRNAJ阳性细胞, Ir刑A皿在伤后1d达到高峰,一直持续至伤后18d, Toews等【8J还进一步发现表达mRNAJE的细胞正是许旺 细胞.mRNAJE出现及其高峰时间在巨噬细胞聚集激 活之前,其整个时程又与巨噬细胞的聚集过程相一致, 所以他们认为许旺细胞及JE蛋白在巨噬细胞激活中 有着重要作用.然而他们仅在mRNA水平进行研究, 至于mRNAJE是否能转录合成JE蛋白,JE蛋白能 否被分泌至胞体外及其生物学活性如何尚未明确.本 研究发现外周神经损伤后,许旺细胞分泌物中含有可 激活巨噬细胞的物质,但其是否正是.『E蛋白或者另有 其他成分存在还需进一步研究证实. 外周神经损伤后,许旺细胞参与激活巨噬细胞,激 活的巨噬细胞又可刺激许旺细胞增殖,促进其分泌9. 可见这些非神经元细胞在神经损伤和修复过程的作用 是复杂而相互关联的,也是反馈调节与逐级放大过程. 参考文献 1王国英,胡耀民,钟世镇.巨噬细胞在周围神经损伤和再生 中的行为及其作用.神经解剖学杂志,1994,10:83—88. 2PerryVH,BrownMC.Roleofmacroplmgesinperipheralnerve degenerationandrepair.Bioessays,1992,14:401—4O6. 3IJndholmD,HeumannR,MeyerM,eta1.Interleukin一1regulates synthesisofnervegrowthfactorinnon-neUl’Ol’k’tlcellsofratsciatic nerve.Nature,1987,330:658—659. 4WilliarnsPL.HallSM.Prolongedinvivoobservationsofnormal peripheralnervefibresandtheiracutereactionstocrushanddehb— eratetrauma.JAnal,19r71,108:397—408. 5秦煜,顾立强,吴岚晓,等.感觉性和运动性神经来源许旺 细胞神经生长因子的表达.中华显微外科杂志,2001,24: 278—280. 6刘黎军,朱家恺,顾熊飞.许旺细胞源神经营养因子对脊髓 前角运动神经元的保护作用.中华显微外科杂志,20OO,23: 39_41. 7CarrollSL,FrohnertPW.ExpressionofJE(monocytechemoat— trdelantprotein-1)isinducedbysciaticaxotomyinwildtypetO— dentsbutnotinC57BL/Wld(s)mice.JNeuropatholExpNeurol, 1998,57:915—930. 8ToewsAD,BarrettC,MorellP.Monocytechemoattractantprotein 1isresponsibleformacroplmgerecruitmentfollowinginjurytosciat— icnerve.JNeurosciRes,1998,53:2印一267. 9马向阳,于涯涛,钟世镇,等.巨噬细胞条件培养基促进许 旺细胞分泌神经生长因子的实验研究.中华显微外科杂 志,1999,22:120—121. (收稿日期:20O2—01.10)