实验一 植物根系活力的测定 - 地理科学学院-福建师范大学

实验一 植物根系活力的测定 - 地理科学学院-福建师范大学 实验指导 指导老师 马红亮 福建师范大学地理科学学院生态系 实验一 植物根系活力的测定(α-萘胺氧化法) 植物根系的作用，主要有(1)对地上部的支持和固定;(2)物质的贮藏;(3)对水分和盐类的吸收;(4)合成氨基酸、激素等物质。因此根系的活力是植物生长的重要生理指标之一。 一、实验目的 通过实验，掌握用α,萘胺法测定植物根系活力的原理和技术。 二、实验原理 植物的根系能氧化吸附在根面的α?萘胺，生成红色的α—羟基—1—萘胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色，其反应如下: 根对α-萘胺的氧化能力与其呼吸强度有密切关系。日本人相见、松中等认为α-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的催化作用，该酶的活力愈强，对α—萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可根据染色深浅定性地判断根的活力;也可测定溶液中未被氧化的α-萘胺量，计算已被氧化的α-萘胺量确定根系活力的大小。 2 在酸性环境中对氨基苯磺酸与亚硝酸盐先反应，再和α-萘胺作用生成红色的偶氮染料，可在510nm比色测定α-萘胺含量。其反应如上。 三、实验仪器药品 分光光度计，天平，烘箱，三角烧瓶，量筒，移液管，刻度试管 Α-萘胺溶液:称10mg α-萘胺，先用2ml左右的95%酒精溶解，然后加水到200ml，成50μg/ml的溶液。 0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.0(见附表2) A液: 0.2mol/L磷酸二氢钠(NaHPO?2HO 27. 8g配成1000ml)。 242 B液: 0.2mol/L磷酸氢二钠(NaHPO?7HO53.65g或NaHPO?12HO71.7g242242配成1000ml)。 用时取A液39ml，B液61ml混合，稀释至200ml即成。 1%对氨基苯磺酸:将1g对氨基苯磺酸溶解于100ml 30%的醋酸溶液中。 亚硝酸钠溶液:称10mg亚硝酸钠溶于100ml水中。 四、实验操作步骤 定量测定 (1) 挖出水稻植株，并用水洗净根系上的泥土，剪下它的根系，再用水洗，待洗净后用滤纸吸去根表面的水分，称根 称2g根放在100ml三角烧瓶中。然后加50μg/ml的α—萘胺溶液与磷酸缓冲液(pH7.0)等量混合液50ml，轻轻振荡，并用玻璃棒将根全部浸入溶液中，静置10分钟。吸取2ml溶液，测定α—萘胺含量[测定方法见下面(2)]，用为试验开始时的数值。再将三角烧瓶加塞，放在25?恒温箱中，经一定时间后，再进行测定。另外，还要用一只三角烧瓶置同样数量的溶液，但不放根，作为α—萘胺自动氧化的空白，也同样测定，求它自动氧化量的数值。 (2) α-萘胺含量的测定 吸取2ml溶液，加入约10ml蒸馏水，再在其中加入1%对氨基苯磺酸溶液1ml和亚硝酸钠溶液1ml，在室温中放置5分钟，待混合液变成红色，再用蒸馏水定容到20ml。在20?60分钟内进行比色。选用波长510nm，读取吸光度，查对曲线得相应的α?萘胺浓度。 3 从试验开始(10分钟)时的数值减去自动氧化的数值，即为溶液中所有的α-萘胺量，再减去试验结束时α-萘胺含量，即得试验其间为根系所氧化的α-萘胺量。被氧化α-的萘胺量以μg/(单位根干重?小时)表示之。因此，还应将根系烘干称其干重。 (3) 绘制α-萘胺标准曲线 分取浓度为50μg/ml的α-萘胺溶液0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0ml于试管中配制系列溶液，加蒸馏水10ml，1%对氨基苯磺酸溶液1ml，和亚硝酸钠溶液1ml，在室温中放置5分钟，混合液即变成红色，再加蒸馏水定容到25ml，在20?60分钟内进行比色，波长为510nm，读取吸光度(A)，然后以A为纵坐标，α-萘胺浓度为横坐标，绘制标准曲线。 五、实验数据分析 根据第一次和第二次样液所测得的吸光度值，从标准曲线查出α,萘胺含量，按下公式计算α,萘胺氧化值。 [M1,M2] × 48 α,萘胺氧化总量(μg) = ————————————————— 测定时提取液用量(ml) M1:第一次取液测定值(μg);M 2: 第二次取液测定值(μg) [C1,C2]× 48 α,萘胺自发氧化总量(μg) = ———————————————— 测定时提取液用量(ml) C1: 第一次空白测定值(μg);C2: 第二次空白测定值(μg) 公式中:48— 测定时提取液总量(ml) α,萘胺氧化总量(μg), α,萘胺自发氧化量(μg) α,萘胺生物氧化强度 , —————————————————————— -1–1(α,萘胺μg?g根?h) 反应时间(h)×根鲜重(g) 4 实验二 叶绿体色素的提取分离和理化性质 一、实验目的 了解叶绿素提取分离的院里以及它们的光学特性在光合作用中的意思。 二、实验原理 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可用丙酮将它们从叶片中提取出来。并可根据它们在有机溶剂中的溶解度不同，以及在吸附剂上的吸附能力不同，将它们彼此分离开。 叶绿素是一种双羧酸的酯，可与碱发生皂化作用，产生的盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素与类胡萝卜素都有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光;叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快;叶绿素中的镁可被H，取代而生成褐色的去镁叶绿素;加入铜盐作用，后者则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色植物的浸渍标本。 三、实验仪器药品 离心机，研钵，漏斗，大试管(120ml，大约直径2.5cm，长23cm左右，36 2个)，软木塞(36个)，毛细滴管，刻度试管，分液漏斗，滤纸一张约10m 丙酮，碳酸钙，甲醇，醋酸酮，盐酸，氢氧化钾，石英砂，无水硫酸钠，四氯化碳，乙醚。 四、实验操作步骤 1(叶绿体色素的提取 (1)取菠菜或其他植物新鲜叶片4,5片(2g左右)，洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 (2)研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加5ml丙酮，研磨至糊状，再加10ml 丙酮，提取3,5min，丙酮提取液倒入离心管离心，离心后上清液转入刻度试管，剩余的残渣用约5ml 丙酮反复多次研磨、冲洗，再次转入离心管后离心，上清夜一并转入试管，定容至30ml。 5 2(叶绿体色素的分离 (1)把展层用的滤纸剪成2cm×20cm的纸条，将其一段剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条。(2)用毛细管吸取叶绿体素溶液(第一次提取离心后较浓的丙酮溶液)点于窄条的上方，注意一次所点溶液不可过多，风干后再点，这样重复点几次，使展层后效果好一些。 (3)在大试管中加入四氯化碳3,5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄条浸入溶剂中(色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁)，盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。待溶剂前沿达滤纸条上1.5-2.0cm时，取出滤纸条，立即用铅笔再溶剂前沿划线作记号。并观察色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。 3、叶绿体色素的理化性质(观察) 1(光对叶绿素的破坏作用 (1)取2支小试管，其中两支各加入3ml上述丙酮提取液，1支放在强光 40min后对比观察颜色有何变化，解释下，另1支放到暗处(或用黑纸包裹)， 其原因。(如果天气晴朗，太阳光强烈可选作，) 2(铜代作用 取两支试管，第一支试管加叶绿体色素丙酮提取液2ml，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液2ml，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，则又产生鲜亮的绿色。此即形成了铜代叶绿素。观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。解释原因。 3(黄色素与绿色素的分离 取上述色素丙酮提取液10ml，加到盛有20ml乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入30ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层。色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液2次。然后于色素乙醚溶液中加入5ml30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置约10分钟，再加蒸馏水约10ml，摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层，分别收集于试管中。 6 实验三 不同施氮水平下植物生理响应分析 一、实验目的与要求 了解综合试验方法，硝酸还原酶活性、叶绿素和总糖含量的测定原理和方法;分析不同氮水平对植物硝酸还原酶活性、叶绿素和总糖含量的影响;学习实验数据的处理与分析。 要求掌握仪器的使用，对实验结果以综合报告的形式表达，理解综合实验设计的目的和意义。 二、实验内容及意义 在不同氮水平下，通过培养的方法，培养一段时间后，让植物充分地吸收氮素后，通过分析不同氮水平下新鲜植物组织中硝酸还原酶活性、叶绿素a, b含量以及烘干样总糖的含量，分析氮与植物生理机理的关系。 三、实验设计与方法 实验设置三个氮(N)水平(即处理)，对照(CK，不加氮素)，低氮(LN)，高氮(HN)，用尿素配置氮溶液。实验对象为树苗(还可以根据实际情况选择其他植物)，根据班级人数(m)分组，每组n人，每个处理设置(m/3)/n个重复。在实验室培养3周，期间分三次加入土壤，培养结束后开展综合实验，每组同学分析其中的一个重复，最后将数据集中起来，交叉分配给每个学生进行综合分析，并提交综合报告。 四、数据分析方法 综合实验报告是在老师汇总全班同学实验结果的基础上，由学生自己根据安排对实验结果利用SPSS软件进行统计分析，以图表(使用office软件中EXCEL和WORD功能)的形式给出，并作适当的分析，分析氮的作用，总结实验结果。 五、附件 7 附件一: 硝酸还原酶活性的测定 硝酸还原酶(缩写NR)是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。 一、实验目的 通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。 二、实验原理 硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关，不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作 --用于NO使还原为NO; 32 +-- NO + NADH + H?NO+ NAD + HO 322 - 产生的NO可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应2 - 溶液中NO的含量的增加，即表明酶活性的大小。 2 - NO含量的测定用对磺胺(对氨基苯磺酸胺)比色法。在酸性条件下亚硝酸2 与磺胺反应生成重氮盐，再和α-萘胺偶联生成紫红色偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。 三、实验仪器药品 分光光度计，分析天平，烘箱，三角烧瓶，剪刀，移液管，刻度试管 0.2MKNO:将20.22克KNO溶于1000ml蒸馏水中。 33 0.1M磷酸缓冲液(PH=7.5): 贮备液A:0.2mol/L NaHPO4溶液(27.8g NaHPO4?HO配成1000ml)。 222 贮备液B:0.2 mol/L NaHPO溶液(53.65g NaHPO?7H2O或NaHPO?12HO 242424271.7g配成1000ml) 取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml 磺胺试剂配制:取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml. 8 α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。 NaNO标准溶液:1克NaNO用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸22 馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO 5微克，用时稀释之。 2 四、实验操作步骤 1、 将新鲜叶片(蓖麻、向日葵、小麦、棉花等)，用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约1.0克。分别置于含有下列溶液的50ml 三角瓶中。 A: 0.1M磷酸缓冲溶液5ml，0.2M KNO5ml 3 B: 0.1M磷酸缓冲溶液5ml，蒸馏水5ml 然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部(如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部)，取出小烧杯置于30?温箱中，使不见光保温作用30分钟。 注意取样前叶子已进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使酶活性降低，此时可于反应溶液中加入30ug 3-磷 -酸甘油醛或1.6-二磷酸果糖，能显著增加NO的产生。 2 2、NO含量的测定 2 保温30分钟后，分别吸取反应液2ml于试管中，加入对氨基苯磺酸2ml及α–萘胺2ml混合摇匀，定容至20ml，静置20分钟生成红色，用比色计进行比色测定。比色用520nm记下光密度读数，从标准曲线上查得的含量，然后计算酶 -活性，以每小时每克鲜重产生的NO微克表示。 2 3、 绘制标准曲线 吸取5ug/ml的NaNO溶液0, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2, 1.6ml于试管中，加入对氨基2 苯磺酸试剂2ml及α–萘胺试剂2ml，混合均匀，定容至20ml，静置20分钟(或于一定的温度的水浴中保温20分钟)，于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光密度，然后于坐标纸上绘制光密度—浓度曲线，以吸光度(A)为纵坐标，NaNO浓度为横坐标。 2 9 五、实验数据分析 根据磷酸缓冲溶液和KNO处理，磷酸缓冲溶液和蒸馏水处理样液所测得的3 吸光度值，从标准曲线查出NaNO含量，按下公式计算硝酸还原酶(NR)活性。 2 A:加有磷酸缓冲溶液和KNO处理溶液中NaNO含量， 32B:加有磷酸缓冲溶液和蒸馏水处理溶液中NaNO含量 2 10 附件二: 叶绿素a和b含量的测定(分光光度法) 一、实验目的 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 二、实验原理 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert—Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 如图9叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。 根据Lambert—Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系(参阅实验86): A=C?k+C?k (1) 1aa1bb1 A=C?k+C?k (2) 2aa2bb2 11 式中:C为组分a的浓度，g/L。 a C为组分b的浓度，g/L。 b A为在波长λ(即组分a的最大吸收峰波长)时，混合液的吸光度A值。 11 A为在波长λ(即组分b的最大吸收峰波长)时，混合液的吸光度A值。 22 k为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ时的吸光a11 度A值。 k为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ时的吸光b22 度A值。 k为组分a(浓度为1g/L)在波长λ时的吸光度A值。 a22 k为组分b(浓度为1g/L)在波长λ时的吸光度A值。 b11 从文献中可以查得叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸 收系数k值如下: 波长(nm) 叶绿素a 叶绿素b 663 82.04 9.27 645 16.75 45.60 将表中数值代入上式(1)、(2)，则得: A=82.04×C+9.27×C 663ab A=16.75×C+45.60×C 645ab 经过整理之后，即得到下式: C=0.012 7 A—0.002 69 A a663645 C=0.022 9 A—0.004 68 A b645663 如果把C，C的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形ab 式: C=12.7A—2.69A (3) a663645 C=22.9A—4.68A (4) b645663 C=C+C=8.02A+20.21A (5) tab663645 12 (5)式中C为总叶绿素浓度，单位为mg/L。 t 利用上面(3)、(4)、(5)式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度(mg/L)。 三、实验器材与试剂 离心机，研钵，漏斗，天平，剪刀， 丙酮，碳酸钙，甲醇，醋酸酮，盐酸，氢氧化钾，石英砂，无水硫酸钠，四氯化碳，乙醚。 四、实验步骤 1(色素的提取 取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5g放入研钵中加纯丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，然后反复加80%丙酮5ml，研磨、洗涤，使叶子残体绿色消失，一并转入离心管离心，上清夜用80%丙酮定容至20ml。 2(测定叶绿素含量 取上述色素提取液4ml，用80%丙酮稀释至20ml，以80%丙酮为对照，分别在663nm，645nm处测定吸光度(A)。 3(根据原理中的公式(3)，(4)，(5)分别计算色素提取液中叶绿素a，b，及叶绿素a，b的浓度。最后根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片重色素的含量。 五、实验数据分析 叶绿素的含量(mg/g)= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重(或干重) 13 附件三: 植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮比色法) 一、实验目的 熟悉植物组织中可溶性总糖含量,蒽酮比色法的测定 二、实验原理 蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再与蒽酮作用，形成一种绿色的络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在625nm波长下的吸光度(A)值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强调随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。该方法简便，但没有专一性，对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。 三、实验仪器药品 721型分光光度计，分析天平，恒温水浴锅，烧杯，容量瓶，三角烧瓶，移液管，漏斗，刻度试管， 乙醇，葡萄糖，蒽酮，硫酸，活性炭 葡萄糖标准溶液:称取已在80?烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200μg的标准溶液。 蒽酮试剂:称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸(比重1.84)稀释成1000ml而成。 四、实验操作步骤 1(可溶性糖的提取 称取在110?烘干的、磨碎的植物样品50mg于10ml离心管中，加入4ml80,的酒精，置于80?水裕中不断搅拌40分钟，离心，手机上清夜，残渣加2ml80,的酒精重复提取2次，合并上清夜。在上清夜中加20mg活性炭，80?脱色30分钟，定容至10ml,过滤后取滤液测定 2(显色及比色 吸取上述酒精提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度(A)。从标准曲线上查得滤液中的糖含量(或经直线回归公式计算)，然后再行计算样品中含糖百分数。 14 3(绘制标准曲线 取200μg/ml标准葡萄糖溶液0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5ml，不足1ml的加蒸馏水补足后稀释成一系列不同浓度的溶液，加蒽酮试剂5ml混合之。按上述方法显色后，分别测得其吸光度，然后绘制A,糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。 五、实验数据分析 计算样品中含糖% 设V为植物样品稀释后的体积(ml) C为提取液的含糖量(μg/ml) W为植物组织鲜重(g) 则得计算式如下: 15 福 建 师 范 大 学 综 合 性 实 验 实 验 报 告 实验课程名称: 植物生理学 实验项目名称: 不同施氮水平下植物生理响应分析 学院: 专业: 指导教师: 报告人: 学号: 班级: 实验时间: 实验报告提交时间: 16 摘要 怎么做、为什么做，主要结果，主要结论，(其他) 100字左右(中英文) 前 言 做该实验的依据是什么或为什么要做这个实验，准备做什么内容 200字左右 材料与方法 介绍实验的材料或对象，如何安排实验、如何管理等，主要通过什么方法、仪器获得数据、分析数据。 结果与讨论 结果的科学叙述与分析，主要以图表的形式表达，以文字的形式介绍，文字不能是图表的简单重复，而是揭示数据内在的规律、信息等。 讨论主要从实验目的、处理和分析出发，讨论实验中发现的主要问题或可能的主要结论 参考文献 可以是文献，也可以是参考书 综合实验总结 通过完成综合实验，总结其中的得失、体会、个人的态度或看法等。 指导教师批阅意见: 成绩评定: 指导教师签字: 年 月 日 17