超声对酵母细胞膜通透性的影响_cropped

超声对酵母细胞膜通透性的影响_cropped 111 ,21 ,3 卢 丘泰球罗登林群刘晓艳 () () ()1 华南理工大学 ,广州 ,5106402 广东药学院 , 广州 ,5102243 仲恺农业技术学院 ,广州 ,510225 )(摘 要 用不同参数的变幅杆浸入式超声波作用酵母细胞 ,测定细胞内核酸 、蛋白质及 FD P 1 ,6 - 二磷酸果糖 3 种物质渗出率 ,再用透射电镜观察细胞形态 。探讨超声场对酵母细胞膜通透性影响的最佳参数及机理 。结果 示 ,超声场的最佳参数是 :电功率 500 W 、脉冲时间 3s 、间隙时间 4 s 、脉冲总时间共 225s ,影响酵母细胞膜通透 性变化的主要机制是空化作用使细胞膜在一定程度上损伤产生穿孔效应 ,细胞膜的通透性提高 。 关键词 超声 , 细胞膜 , 通透性 细胞膜的重要功能之一是选择通透性 。通过选 上海新芝生物技术研究所 ; 透射电镜 , F E I2Tecnai12 , 择性地通透 ,细胞能接受或拒绝 ,保留或排出某种物日本电子 。 1 质。人为地改变细胞膜的通透性 , 可以改变原料 1 . 2 实验方法 的输入或代谢产物的排出速率 ,以利于代谢产物在细 1 . 211 细胞培养 ( 胞外的积累 ,使代谢朝着人们希望的方向进行 ,是实 将酵母接种到发酵培养基 CHO, 0155 mol/6 12 6 现代谢人工调控的重要方法之一 。而常用方法是添 L 、NaHPO, 012 mol/ L 、Na HPO, 012 mol/ L 、 2 4 2 4 ) 加药物的化学法 、反复冻结和解冻的物理法 。MgCl,0101 mol/ L 中 , 温度为 3715 , 3815 ?, 摇床 2 目前应用较为广泛的是化学的传统法 。其缺点 转速 120 r/ min ,发酵时间为 1 d 。 是效率低 ,胞内物质释放率低 ,处理时间长 ,试剂用量 11212 超声处理大 ,成本高 ,同时后处理也有诸多不便 。且由于化学 将发酵液放置于冰水浴中 ,用超声处理 。将处理 2 试剂的毒性 ,进一步分离时需用透析等方法除去。 后的发酵液继续发酵 2 h 。发酵完毕后 ,取 20 mL 发 超声波法效率高 ,处理时间短 ,无化学试剂残留 ,更没 酵液于 80 ?的水浴中灭酶 ,剩余部分用于测细胞染 有进一步除毒的必要 。低频超声的空化作用可以导 致细胞的非热生物效应 ,使细胞膜短时局部破裂 ,从 色率 。变幅杆浸入式超声的作用参数 : 频率 20 , 25 而改变细胞质膜的通透性 ,使细胞内物质释放或细胞 k Hz ,功率分别为 600 W ,500 W ,400 W ,超声的作用 外物质进入细胞内 。本文就是采用超声波来处理酵 时间为每次 3 s ,间隔时间为 4 s ,作用的总时间分别 母细胞 ,观察其通透性的变化情况 ,在不同参数的变 90 、135 、180 、225 、270 s 。容器的直径为 :415 cm 。幅杆浸入式超声波条件下 ,细胞内核酸 、蛋白质 11213 核酸 , FD P 和染色率测定 及 FD P 这 3 种物质的渗出率 , 并利用透射电镜观察 对细胞分析及作用机制探讨 。 核酸的测定参照文献 4 。 FD P 的测定参照文献 5 。 细胞存活率的测定参照文献 6 。 11214 透射电镜观察1 与方法 将酵母接种到发 酵 培 养 基 中 , 摇 床 转 速 120 r/ min ,3715,3815 ?发酵 1 h ,分别进行如下处理 : 1 . 1 材料与仪器 ( ) A : 不做任何处理 ; 酵母 S accha rom yces ce rev isi ae ,活 性 干 酵 母 , B : 梅山马利 ; 微量取液 器 , 北 京 青 云 航 空 仪 表 有 限 公 变幅杆浸入式超声处理 ; 司 ; 752 紫外分光光度计 ,上海精密科学仪器有限公 B: 频率 20,25 k Hz ,功率为 300 W ,每次 3 s ,1 间隔时间为 4 s ,作用的总时间分别 90 s ; 司 ; 灭菌锅 ,上海三申 ; 恒温振荡器 , T HZ - C ,江苏 B: 频率 20,25 k Hz ,功率为 500 W ,每次 3 s ,2 太仓市实验设备厂 ; 电动离心机 80 - 2 ,上海悦丰仪 间隔时间为 12 s ,作用的总时间分别 270 s 。 将处理表有限公司 ; 变幅杆浸入式超声波处理机 ,J Y922 ?, 后的样品经戊二醛固定 、纯 812 树脂包埋 第一作者 :博士 ,讲师 。 18 h 后用 L KB27800 型超薄切片机切片 ,然后用 F E I2( ) 3 国家自然科学基金资助项目 批准号 :10174021 收稿日期 :2005 - 05 - 16 Tecnai12 透射电镜观察 ,定位摄影 。 图 1,图 3 表明 ,随着超声作用时间的增加 , 不 结果 2 同功率的超声都使胞内核酸 、蛋白质及 FD P 的渗出 不同功率超声对细胞膜通透性的影响 211 浓度逐渐提高 。其中 600 W 超声的作用最为明显 , 500 W 次之 ,400 W 最差 。超声的作用时间在 135 s 以内时 , 核酸 、蛋白质及 FD P 的渗出浓度的增幅不 很明显 ,在 225 s 左右 ,胞外的核酸 、蛋白质 、FD P 的 测定值增幅较大 。 图 1 超声对核酸渗透的影响 图 4 超声对细胞存活率的影响 图 4 可知 ,随着超声作用时间的增加 ,细胞的死 亡率都逐渐增加 ,也就是存活率下降 。600 W 的超声 使细胞死亡率增加最快 , 500 W , 400 W 最慢 。也就 是说 500 W , 400 W 超声对细胞的活性影响最小 , 但 是 , 500 W 时细胞通透性好 , 600 W 超声对细胞的 ( 活性影响最大 。在 225s 内 ,细胞死亡率在 36 % 600 ) ( ) ( ) W、15 % 500 W、12 % 400 W内 , 大部分 细 胞 存 图 2 超声对蛋白质渗透的影响 活 。 图 1,图 4 可知在一定超声作用下 ,酵母细胞大 数存活 , 其细胞内核酸 、蛋白质 、FD P 向胞外渗透率 提高 ,反映出其细胞膜通透性提高 。提高酵母细胞膜 通透性的最佳功率超声条件为 : 功率 500 W 、作用时 间总 225 s 、脉冲时间 3 s 。 212 透射电镜观察结果 图 5,图 10 的照片为视野中任一个样品的透射 电子显微镜照片 。图 5 是未经过任何处理的酵母细 胞 ,酵母细胞结构完整 ,细胞壁与细胞质界限清晰 ,细 胞结构完好 ; 图 6 、图 7 是经过不同处理方法处理的 图 3 超声对 FD P 渗透的影响 酵母细胞 ,图 6 所观察到的现象与图 5 没有什么差 图 1 、图 2 、图 3 分别是测定发酵液中核酸 、蛋 别 ,图 6 至图 8 中 ,细胞结构仍保持完整 ,膜上出现可 白 、FD P 变化率的趋势曲线 ,也就是细胞外分泌物变 逆小孔 ,但细胞壁颜色逐渐变深 ,是细胞膜通透性变 化反映胞内变化趋势曲线 。大而引起的细胞内物质外渗 ;图 9 中细胞膜有多处断 () ( 核酸 蛋白 、FD P提高率 = 处理后发酵液中裂 ,但仍能看到细胞膜 ;图 10 中几乎观察不到细胞膜 ( ( ) 核酸 蛋白 、FD P的含量/ 未处理 发 酵 液 中 核 酸 蛋 结构 ,但在细胞内可以看到其他质膜结构 ,该条件下 ) ) 白 、FD P的含量- 1 ×100 %超声使酵母细胞膜破裂程度较为严重 。 细胞总数 - 死细胞总数 ×%存活率 = 细胞总数 透射电子显微镜观察可知 ,超声处理后细胞膜有 ,多数细胞的细胞壁颜色逐渐变深 ,是膜受一定损 解 伤 ,产生可逆的小孔后 ,膜通透性增加 ,胞内物外渗引 一定程度损伤 ,并且成可逆小孔 ,即“穿孔效益”,是膜 起 。当超声的强度过大 ,作用时间延长时 ,细胞的崩 通透性提高的主要原因 。 解很快 ,细胞壁颜色逐渐变深到看不清 ,直到镜界全 3 讨 论 是细胞碎片 。 在功率 500 W 、作用时间总 225 s 、脉冲时间 3 s不同功率的变幅杆浸入式超声波都使胞内核酸 、 蛋白质及 FD P 这 3 种物质的渗出率提高 ,作用时间 的超声条件下 ,核酸渗透增加 36 % 、蛋白质渗透增加的长短对胞内核酸 、蛋白质及 FD P 的渗出率有不同 22 % 、FD P 渗透 增 加 60 % , 细 胞 存 活 率 为 85 % 。此 的影响 。其中胞内核酸 、蛋白质渗出率在超声的作用 时细胞膜有一定损伤 ,但细胞不死亡 ,一定时间后又 时间为 225 s 时 ,达到最大值 , 之后降低原因需进一 恢复正常 。 步探讨 ; FD P 渗出率随作用时间的增加而提高 ,225 s 后仍增加原因需进一步探讨 。膜通透性改变程度与 参 考 文 献 功率 、作用时间密切相关 。随着超声作用功率 、时间 的增加 ,细胞的死亡率逐渐增加 ,存活率都逐渐减小 , 大连轻工业学院 1 生物化学 M 1 北京 : 轻工业出版社 , 1 即细胞的破碎程度增大 。提高超声作用功率 、延长作 19801492 用时间 ,将不利于细胞保持活性 ,同时由于在高功率 段学辉 ,叶 勤 ,张嗣良 1 啤酒酵母的通透性对 A TP 生产活 2 长时间的作用下 ,设备发热量大 ,易使设备损伤 ,不利 () 性的影响 J 1 华东理工大学学报 ,2000 ,26 1:33,36 于设备的维护 ,一般不采用 600 W 以上的超声长时 3 冯 若 ,李化茂 1 声化学及其应用 M 1 合肥 :安徽科学技 间处理 。 术出版社 ,1992 . 23,24 选择适宜的超声条件既要考虑功率大小 、作用时 沈 同 ,王镜岩 1 生物化学上册 M 1 北京 :高等教育出版 4 间 、还要考虑细胞的存活情况 。在一定超声条件下作 社 , 1990 . 87 ; 347 用酵母细胞 ,可以提高细胞膜的通透性 ,但细胞又不 王 蕾 ,孙志浩 1 果糖21 ,62二磷酸的酶法测定 J 1 工业 5 () 微生物 ,1994 ,24 4:15,18 死亡 ,通过测定细胞染色率 、FDA 、蛋白质 、核酸的提 6 微生物研究法讨论会编 1 微生物学实验法 M 1 北京 : 科高率来反映 。 学出版社 ,1981 透射电镜观察超声处理样品中有少量细胞的崩J u Chu , Bailin Li , Siliang Zhang1 On2line ult rasound stimu2 7 lates t he secretio n and p roductio n of gentamicin by Mi2 cro mo nospora echinospora J 1 Process Biochemist ry , 2000 , () 35: 569,572 Rep ,1988 , 17 :482,499 8 Trick H N , Finer J J1 SAA T : so nicatio n2assisted Agrobac2 2mediated t ransformatio n J terium1 Transgenic Res , 1997 10 李重九 ,侯玉霞 ,蔡祝南 ,等 1 用超声波法使烟草花叶病 () 6:329,336 () 毒侵染烟草细胞 J 1 植物病理学报 ,1999 ,29 1:86,90 9 Trick H N , Finer J J1 So nicatio n2assisted Agrobacterium2me2 11 刘晓艳 ,丘泰球 ,刘石生 ,等 1 超声影响微生物细胞膜通 ) ( () diated t ransformatio n of soybean [ Gl yci ne m ax L 1 M er2 透性及其应用 J 1 应用声学 ,2002 ,21 2:26,29 ril l ] embryogenic suspensio n cult ure tissue J 1 Plant Cell Eff ect of Ultra soun d on Membrane Permea bil ity of S acc h a r omyces ce revis i ae 1 ,21 ,311 L u Q unL u Xiao yanQiu TaiqiuL uo Dengli n ( )1 Sout h China U niversity of Technology , Guangzhou , 510640 , China ( )2 Guangdo ng College of Pharmacy , Guangzhou , 510224 , China ( )3 Zho ng2kai College of Agricult ural Technology , Guangzhou , 510225 , China ABSTRACT The release of nucleic acid , p rotein and FD P were deter mined o n S accha rom yces ce rev isi ae cell by different parameters of ult raso und1 The cell co nfiguratio n was assayed by t ransmissio n elect ro n micro scop y ( ) T EM. The aim of t his paper was to st udy t he op timal parameters and mechanism of S accha rom yces ce rev isi ae cell membrane per meabilit y induced by ult raso und1 The op timal parameters were power 500 W , t reating time 225s p ulse 3s and interval time 4s , respectively1 The mechanism of ult raso und induced cell membrane per meabilit y was t hat t he cavitatio n effect of ult raso ud led to t he perfo rated effect resulted f ro m cell membrane damage1 Ult raso ud co uld increase t he per meabilit y of S accha rom yces ce rev isi ae membrane1 Key words S accha rom yces ce rev isi ae , ult raso und , membrane per meabilit y