解淀粉芽孢杆菌J5防治桃流胶病研究

解淀粉芽孢杆菌J5防治桃流胶病研究 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权 学位论文 年 月 日 如需保密,解密时间 召 是否保密 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究作及取得的研究成 果。尽我所知。除了文中特别加以标注和致谢的地方外。论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包舍为获得华中农业大学或其饱教育机构的学位或证书 而使用过的材料,指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文书傲了明确的说明,并表示了谢意。 研究生签名:白?了勺 时阖:移多年‘月丑 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存,使用学位论文的规定,却学生必须按 照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本洋校有权保存提交论文的印刷版和电子版。 并提供目录检索和阅览服务。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 都或部分内容,为存在馆际合作关系的兄弟高梭用户提供文献传递和交换服务.同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注:保密学位论文即涉及技术秘密.商监秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文在解密后适用于卒授权书。 羧毛讪, 撇姗豫专?哆撇名:奄善%获 签名日期:。 ,年?月乍日 签名日期:如多年?月弓日解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 目 录 摘要?.??...?.?...??.?...?.,.....?....?. 第一章文献综述? 利用内生细菌进行生物防治的研究概况?.. .植物内生细菌概述. .内生细菌在植物病害防治上的应用..内生细菌作为生防菌的优势.. ..内生细菌对植物细菌病害的防治作用??一 ..内生细菌对植物真菌病害的防治作用??.. 桃树流胶病研究概况? .桃树流胶病的危害 .桃流胶病的病原相关研究 ..病原菌. ..桃流胶病致病机理?. ..生物学特性?. .病害循环及流行规律..病原菌侵染?. ..流行规律??. .桃流胶病的防治? 选的目的与意义? 第二章桃流胶病病害调查与分析??. 材料与方法? .田问发病情况调查??。 ,.调查对象..调查分析方法 ..调查时间与频率??华中农业大学届硕士研究生学位论文 .数据统计? 结果与分析?. .田间发病症状?.. .田问发病情况调查结果一 .. 年调查结果.. 年调查结果.. 年调查结果小结与讨论?... 第三章内生细菌对桃流胶病 拮抗效果的相关 研究 材料与方法?. 试验材料??. ..供试菌株..供试植物.培养基 ..酶和试剂盒? ..主要试剂..抗生素 ..主要仪器试验方法??. ..内生细菌的抗真菌谱测定 ..温度处理对的发酵滤液抑菌效果的影响??一 ..蛋臼酶处理对的发酵滤液抑菌效果的影响?一 .. 发酵液对.一致病的影响? ..浸泡菌液对一致病的影响??. .. 注射桃树枝条对一致病的影响? .. 发酵液的有机萃取 .. 的内生性鉴定??。 结果与分析?. 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 . 的抗真菌谱测定??。 .温度以及蛋白酶处理对的发酵滤液抑菌效果的影响??. . 发酵液对.致病的影响??. .浸泡菌液对.致病的影响? . 注射桃树枝条对.致病的影响??. . 发酵液有机萃取剂的筛选?。 . 内生性的鉴定一 .. 的利福平,标记。.利福平标记的菌株的分离??一 ..分离菌株划线与及. 间隔区序列的扩增 .. 和?间隔区序列的测序比对结果? 小结与讨论? 结论与展望 参考文献? 致谢. 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 摘要 桃 是桃树栽培『的 .流胶病 常见病害。目前,我国报道的侵染性桃树流胶病病原真菌为 .. .,属于葡萄座腔菌属真菌。桃流胶病主要 为害枝干,使发病部位树皮开裂,产生胶状溢出物,其防治工作非常困难。本研究 调查了年到年华中农业大学标本园的桃流胶病发生情况,并以本实验室 分离得到的桃树内生细菌解淀粉芽孢杆菌为研究对象,进行了桃流胶病生物防治 的初步研究,主要结果如下: 通过连续三年的病情调查,初步探讨桃流胶病的病害流行规律。华中农业大学 标本园桃流胶病发病情况比较严重,在大类个不同的桃品种发病情况不同,其 严重度表现为油桃普通桃蟠桃。在调查的时问段月.月内,病情指数维 持在?之间,发病率在%左右,在月中下旬至八月上旬,发病率和病情指 数有小幅下降。 我们以实验室前期分离获得的内生细菌为研究对象,首先测定了该菌株的抗 真菌谱,发现的发酵滤液能抑制包括桃流胶病菌在内的多种病原真菌的生长。采 用室内枝条接种的方式,检测了抑制桃流胶病发生的效果,结果表明处理能 有效抑制桃枝条流胶病的发生。 对菌株的发酵滤液中起到拮抗桃流胶病原真菌的物质用不同的有机溶剂进行 了萃取,发现四氯化碳萃取后的有机相中含有抑菌成分,为之后的研究中可能进行 到的鉴定工作奠定基础。 同时,对菌株的内生性进行了验证。用抗生素利福平筛选标记菌株, 注射到桃树上,个月后采集不同部位样本,分离出标记的菌株。 目前有关桃流胶病生物防治的研究报道比较少,本文初步研究了通过内生性细 菌对桃流胶病进行生物防治的工作果,为桃流胶病生物防治途径的研究提供了一 些参考。 关键词:桃流胶病:病害调查;内生细菌:生物防治:抗生素标记:分离检测华中农业大学届硕士研究生学位论文 . . .,. . ., . . 脚 . ., ? %.. , ., ,区. . ..’ . ,、? 丑 . ?. 埘 丑. . . . . : ; ;; ; 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 第一章文献综述 利用内生细菌进行生物防治的研究概况 .植物内生细菌概述 关于“植物内生细菌” 的概念,是由于年 首次提出的,。直到年,才将植物内生菌的概念进行 了一个系统的概括:植物内生菌是指能在整个或部分生活周期中侵染活植物 体的真 菌和细菌,但在侵染后对植物组织不会引起明显的症状 ,。 植物内生细菌广泛存在与自然界中,部分内生细菌具有广谱抗菌活性以及极 强 的抗逆能力,且不污染环境,对人畜无害,已经成为国内外的研究热点,据目 前的 文献报道,从植物中已经分离得到多种植物内生细菌,它们分别隶属于不同的种属。 有些具有促进寄主植物生长与防治病害的有利作用,有些则具有潜在的致病性卢 镇岳等,。 据不完伞统计,目前已报道多种植物中存在内生茵,大都以农作物及果蔬等 经济作物为研究对象,如小麦、水稻、棉花、花生、马铃薯等。在各植物中发现的 内生细菌己达利,隶属于个属韩继刚,宋未,。其中以假单胞菌属 杨海莲等,、芽孢杆菌属、肠杆菌属 .以及土壤杆菌属最为常见。 年邹文欣将植物中常见的内生细菌的种类以其及在植物组织内的分布作了比较详细 的统计见表一。在已研究的作物中,几乎都能够分离到内生细菌,这些内生细 菌存在于植物的根、茎、叶、花、果实、胚、种子和块根等各个组织器官,甚至在 豆科植物的根瘤中也有内生细菌的存在。华农些查堂旦堡主塑窒兰堂堡笙壅 ???????????????????????????????????????????????????????一一 一一 表不同植物中内生细菌的种类及分布情况 , 砌甜船曲砌、帅仂妇砷肠、 根 甜菜 , ,妙妇阳,咖? 砌根 柠檬 . , , ,、印、 、 ., 、 .,.,.、 ;、 .。 .、 , .、 咖啡豆 、 ., ’ 果实 , 黄瓜、番茄 、 ,蛔..、 , .、 蝴母 棉花 紫妻、 叶、皴 , . 根、买、 .。 .、 种子、花晒肪麟.、砂川胁耙一埘. , .。 、 三叶草 很 、.、 .、、 、 母 , 卫 甘蔗 ?, . 、 , 墓 玉米 、., 、 , 、 玉米 摹 . , 块茎 马铃薯 , .. 根、 玉米、,矗 , 块茎 掣疗、、 马铃薯 . 把, , 根至 玉米 . ., .、 .、 .、 .、 .、砌腩 .、 、.,.、 一一. 一????‘????????????????????????????一 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 , 玉米 茎 .、 、 、 玉米 , 删.、 ., .、 .、 、 茎 葡萄树 、, 、 . 、.、 置、 .、 .、 、、丑、 . 、.、 .、 、 、 、 、跆 .、.、, 肾、、 ,.、, ., .内生细菌在植物病害防治上的应用 一直以来,化学防治是各种植物病害的主要防治,但是由于长期使用化学 药剂会导致病原菌产生相应的抗药性并且农药残留对环境会造成严重污染,再加上 化学农药对~些土传病害的防治效果比较差,因此,寻找一种新的防治手段来取代 化学防治成为植物病害防治趋势,由于内生菌能在植物体内定殖,而且部分内生菌 具有较好的抑制病原菌的效果,因此被作为一种潜在的生防因子广为研究,利用内 生细菌进行生物防治便成了最具潜力的防治方法。 ..内生细菌作为生防菌的优势 在长期的共同进化巾,内生细菌在与植物之间已经形成了一种相互依存的关系, 前者已经成为植物的整个微生态系统的成份之一葛红莲等,。使用内生细菌 作为生防因子相对于其它生防因子而言具有更大的优势:一植物内生细菌分布于 植物的不同组织中,首先占据了有利的生态位,加上植物供应的营养物质充足并且 提供保护作用,因此具有非常稳定的生态环境,;二 .认为内生细菌在与植物长期协同进化的过程中,形成了一种能够免疫寄主植物防华中农业大学届硕士研究生学位论史 卫反应的机制,在受到病原物侵染时,植物会主动产生一些抗菌物质如植保素、 蛋白、酚类化合物等,植物内生细菌由于长期与植物共存,对植物产生的抗菌毒性 物质具有耐受性 ,;三内生细菌可与病原菌直接作用。在面 对病原菌的侵染时,植物中的内生细菌可以直接攻击病原菌或其致病因子,诱导植 ., 物产生或者相关的拮抗物质来抑制病菌的侵染 .., ,;四除了能在植物体内定殖和传导外,还可以使用植物内生细 菌作为载体将外源基因导入植物而不改变植物本身的基因,这样就能在保持植物本 身的性状的同时使植物获得与转基因植物相似的功能,进而提高植物的抗病虫能力, .. 刘云霞,张清文,: ..,;徐静等,。 虽然内生细菌在病害生物防治方面有较大潜能,但值得注意的是一旦离开植物 体后,专性内生细菌将不能存活,而兼性内生细菌则不同。后者除了能在植物体内 生存外,在植物根际的土壤中也能够存活,因此选用兼性内生细菌作为生防因子要 . 好于专性内生细菌 .,。 ..内生细菌对植物细菌病害的防治作用 自上世纪年代以来,人们就发现内生细菌对植物细菌病害具有防治作用。 等检测了来自马铃薯块茎中的株细菌,发现其中有株可拮抗 密执安棒状杆菌腐朽亚种 .。等 也从马铃薯组织内筛选到了对密执安棍状杆菌坏腐亚种 ..有具拈抗性的内生细菌。杨海莲等报道, 水稻孕穗期叶片在喷施了阴沟肠杆菌的发酵滤液之后,对白 叶枯病的抗性得到明显提高。葛米红从健康水稻植株内分离得到了个对 水稻白叶枯病具有抑制作用的内生细菌菌株..。、?..、一??和 ...,并测定在室外条件下对水稻白叶枯病的防效分别为.%、.%、 .%和.%。蔡学清等人从葫芦科作物及空心菜的叶片、茎及花上分离 .细菌对西瓜细菌性果斑病菌具有较好拈抗效果, 筛选出株芽孢杆菌属 通过抑菌圈法测定其对西瓜细菌性果斑病的防治效果为.%一.%蔡学清,鄢 凤娇,林玉等,。 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 ..内生细菌对植物真菌病害的防治作用 利用内生细菌进行真菌病害生物防治的例子很多。等从甘蓝 叶中分离的种内生细菌对甘蓝黑腐病病原菌甘蓝致病变种具有拮抗活性,试验结 果表明这些内生菌能够抑制病症的发展。 .等从水稻植株内分 离的细菌中有三株菌能够在体外抑制病原菌的生长,减少病害的发生。何红等 对健康辣椒植株体内的内生细菌及拮抗菌进行了分离筛选,株辣椒内生细菌中, 有.%的菌株对香蕉枯萎菌和黄瓜枯萎菌有拮抗作用;来自辣椒叶片和茎杆内的 .和.两个菌株,对种植物病原真菌有较强的拮抗作用,其中对辣椒炭疽 病有.%..%的防病效果,能够在辣椒体内定殖,并鉴定此两个菌株为枯草 芽孢杆菌。芦云等对新疆不同种植地区的健康哈密瓜植株组织中内生细菌 进行分离,得到个菌株,经鉴定分别为芽孢杆菌属 .、黄单胞菌 属 ,、假单胞菌属 .、欧文氏菌属 .、葡萄球菌属 .以及短小杆菌属,其中 芽孢杆菌为优势种群。辜运富等从优良玉米品种川单号中分离到一株对 玉米纹枯病菌具有明显抑制作用的内生细菌,进行盆栽试验表明,其对玉米 纹枯病 抑菌率为.%。进一步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。周婧等从长势健壮 的黄瓜、南瓜和甜瓜苗的根部及茎部分离获得株内生细菌,通过与枯萎尖孢 镰 孢菌进行对峙培养,获得具有抑菌活性的细菌株,占总菌株数的.%。杜黎黎 从甜瓜高抗枯黄萎病的健康植株根部分离出种拮抗性的内生细菌,通过 盆栽实验证实能够有效防治西瓜枯萎病。王坦从健康金叶女贞植株上分离 到的洋葱伯克霍尔德氏菌 菌株对金叶女贞黑斑病具有良 好的防治效果,田问防效可达。%。等人从茁期的棉花植株上分离 到三株芽孢杆菌属内生细菌.、?和,通过室内盆栽试验表明 经过这三种内生细菌菌液处理过的棉花植株在现蕾期前感染棉花黄萎病的 比例分别 为.%一、.%一和.%.,而对照的发病率达%。 桃树流胶病研究概况 .桃树流胶病的危害 桃树流胶病 是桃树栽培中的一种常见病害。该病华中农业大学届硕士研究生学位论文 主要危害桃树枝干,导致树皮开裂,开裂处产生透明至深褐色胶状溢出物。感染流 胶病的桃树树势衰弱,果实品质会明显下降,当发病严重时,树干和主枝被流胶覆 盖,树势衰弱,不久整树死亡。 桃树流胶病曾于上世纪年代在美国佐治亚州大规模爆发,当时人们认为它是 因逆境和粗放管理等引起的生理性病害,而并不认为它是一种侵染性病害,直到 年等人确定其病原物为葡萄座腔菌属真菌,人们才意识到它 也是一种真菌病害。该病对佐治亚州的桃生产带来了严重的影响,大部分桃园的发 病株率在%以上,老一点的果园更达到%,几近绝收 , 。桃流胶病在我国各桃产区的分布也非常广泛,其中以长江流域及以南的地区 较为严重,据统计,一般果园该病的发病率在%以下,而管理粗放的果园可达到 %以上马瑞娟,。自上世纪年代起,我国先后有关于桃流胶病的发生、 流行等相关研究报道。早在年,吴印青等人就对上海市郊的个果园进行了 调查,发现该病在当地株发病率在.%..%之间:罗江会调查了、 年两年重庆永川、璧山、巴南等地区多个桃园桃流胶病发病情况,田间发 病株率最高达.%,平均为.%;华国荣等调查了浙江省桐庐县 ?年个品种的桃流胶病发生情况,发病株率最低%,最高达%,病 情指数介于.?.之问。年我国湖北省孝感、仙桃等地桃流胶病发生严重, 部分利,植品种如油号发病率高达%,给当地的桃生产带来了严重危害陈彦 等,。 .桃流胶病的病原相关研究 .病原菌 . .为桃流胶病病 年,首次确认 原菌,。后来在美国佐治亚州又报道了丑,丑和及 三种致病病菌 ,。日本的和瞄等人则 将该病称之为 为桃 ,并鉴定出 流胶病病原菌 。 国内对于该病病原菌的种类报道各地也不一致。吴印青等沿用 和?的称呼,将上海地区该病命名为“桃疣皮病”:广州地区的桃流胶病菌则 鉴定为葫芦霉菌属和小球腔菌属两种真菌张宝 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 棣等,。;王瑶对湖北武汉、咸宁等个地区个桃流胶病病斑样木 和可可毛色二孢 进行分离、鉴定,认为壳梭孢 为当地桃流胶病的病原菌,这两种菌有形态均为葡萄座 。国内外对于核果类果树流胶病病原菌的报道已有很 腔菌 多,王瑶于年对目前己报道的该病病原菌种类进行了概括,发现其病原菌主 要 为葡萄座腔菌属真菌表一王瑶,,稍作修改。 表.核果类果树流胶病病原种类臣 国家地区 寄主 病原 参考文献 中国湖北省 桃 , 王瑶, 中国山东省 张勇等, 最 最 中国重庆市 嗣桃 罗江会等, 最 中国福建省 刘淇等, 中国广东省 李桃 张宝棣等,‘ . 中国浙江省 最 李红叶和曹若彬, ,.. 梅桃 ..嗣 皿日本 桃桃..桃流胶病致病机理 有关桃流胶病菌的致病机理目前并不清楚,多认为其发生可能与逆境有关。 通 常兼性寄生菌 是与逆境相关的病原菌,具有在寄主组织上 潜伏侵染的特点 .,; .,。同时,当在逆境下发生侵染时, 病原菌的形态也会随之改变。比如在干旱胁迫下,杨树在接种溃疡病菌最 后,细胞器的损伤会增加并发生变形,细胞基质也会外渗,此时病原菌的生长会使 证实在逆境条件下植 得病害加剧王媛,。同时, 物的防御反应也会受到抑制,在干旱条件下,白杨树体内产生的水杨甙和儿茶酚等 化学物质的防御作用会受到削弱。如果同时发生真菌侵染,那么也会影响愈伤组织 的形成 ..。 华中农业大学届硕士研究生学位论文 ..生物学特性 不同葡萄座腔菌属真菌 .的最适生长温度有差异。其中, 菌丝在。下都能生长,最适生长温度为.?, 菌丝生长温度范围在,最适生长温度为。 , 。多项研究表明,温度对 .产孢和分生孢子萌发有影响。置 在。时的产孢量最大;厦在。时产孢量最大;厦在 ,。.等人 温度介于?之间产孢量都很大 发现丑、丑和丑三种葡萄上真菌所产的分生孢子在?高 温下均能萌发,其中最和丑孢子的最适萌发温度分别为。和。; 不同类型的曼分生孢子最适萌发温度有所差异,其透明的分生孢子萌发最 适温度为,而有颜色的则为。 .,。 此外,等人通过不同波长的光照培养证实 .的 产孢也可能与光的波长有关。如在 的黑光灯下光照培养苹果轮纹病菌及 ,能够诱导其产生大量的分生孢子。 .病害循环及流行规律 ..病原菌侵染 葡萄座腔菌属真菌 .可作为腐生菌或植物内生菌在土壤和 .,,但在逆境条件下,如高温、积水时, 健康的植株中存在 该菌便能成功侵染植株,。 .的寄生性比较弱, 具有潜伏侵染的特点,潜伏侵染阶段,病菌先会在寄主植物组织上定殖,在适 宜条 通常在花瓣脱落之后侵染寄主, 件植株开始发病,如苹果白腐病菌 .,。 而果树表现出病害症状则需要到果实收获前?周 不同研究表明 .能从蓝莓,,杏,,,芒果 ., ,苹果,,桃 .,等植物的伤和嫩茎侵染。侵染后, 和白干层 菌丝首先扩展到维管束组织,然后通过细胞间隙横向生长并在不同部位的细 胞如愈 .,。 伤组织,皮层,木质部,管胞和导管中定殖 丑是葡萄座腔菌属中最常见的一种真菌,关于其流行学在一些果树已有研 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 究,如苹果白腐病 ,和阿月浑子花序、新梢枯萎病 .,等。在观察发生苹果树白腐病的树茎部时发现,病原菌分生孢子芽管会 表现出趋化性 , ,向受伤的茎部部位生长 ;侵染后,分生孢子的萌发会随着相对湿度的下降减少,相对湿度达到% 以上时孢子萌发率最高,相对湿度在%时,则仅有不到%的孢子萌发 。 不同的 .侵染时期会有差异。在桃,、蓝莓 ,和阿月浑子,; ., 的整个生长季都能找到侵染源,在桃、蓝莓、阿月浑予果园中,到月份 都能检测到病原菌分生孢子;在美国卡罗莱纳州和佐治亚州,月到月为分生 孢 子水平的高峰期 ,;,。分生孢子主要通过雨水 传播,所以高温和持续的阴雨天气能促进病害的发生 .,。 ..流行规律 一般 .在夏季的检测率最高,和比较了 美国北卡莱罗娜州 不同的苹果园中丑和丑两种病 原菌孢子的释放时间,发现前者的孢子通常在月中旬到月问释放并通过雨水 进 行传播,在苹果树的整个生长季都能在修剪口下方的雨水中检测到这两种真 菌的子 囊孢子和分生孢子,从月下旬到月上旬检测到的孢子量最大。 在果树病残体上往往存在大量分生孢子器和子囊壳,这些分生孢子 器和子囊壳为病害的循环提供侵染源 ,:而腐烂病果上的次 则会进一步加重病害的发生 , 级侵染源 。 还发现成熟的果实对最更敏感。雨水是 分生孢子传播的重要途径 ,,充足的水分和适宜的温度条件 更有利于病害发生。 .桃流胶病的防治 桃流胶病因发生和传播的复杂性使得防治工作十分困难。目前国内外并没有 抗 流胶病的桃树品种的报道。据华国荣等报道,甘前国内对流胶病抵抗能力 最强的是油桃品种晴朗从美国引进,然后是情优和七月香油桃,对该病最感病的 华中农业大学届硕士研究生学位论文 品种是潍坊号油桃。 比较了个桃品种对晟 的抗性,发现所有品种都感病。抗性品种的缺失使得化学药剂杀真菌剂防治成 为桃流胶病的最常用防治手段。使用克菌丹和敌菌丹能使桃 树的树势变强并且增加果实产量,但仍然不能阻止病原菌的侵染 ., 。郑雪芳等在进行防治效果的比较时,采用了流胶灵涂干和多菌灵喷 雾的不同组合处理,发现两种药剂同时使用防治效果最好。然而真菌的抗药性制约 着杀真菌剂防治作用,丑有许多菌株对异菌脲能表现出高水 平的抗药性.,;.,。加强田间管理,控制水涝,及时铲除 病树、清理病果能够在一定程度上减少桃流胶病的危害 .,。此 外,生物防治有望成为一种有效防治桃流胶病的新方式。 选题的目的与意义 桃是我国的一种重要经济果类,桃流胶病是一种桃树上普遍发生的病害,对桃 的生产危害大,采用传统的化学药剂对该病进行防治不仅防效差,而且农药残留会 污染土壤和环境。 实验室前期从桃树植株上分离鉴定出了对桃流胶病具有拮抗作用的内生细菌, 并进行了初步的鉴定以及防效测定。这些内生细菌在桃流胶病的生物防治方面有一 定的应用潜能。 本文选取了其中防治效果最好的一个菌株解淀粉芽孢杆菌进行研究,探讨了 发酵液的抗菌谱及其在室内对桃流胶病的防治效果,并利用抗生素标记实验对 的内生性进行了验证,研究结果为进一步利用内生细菌防治桃流胶病奠定了基础。 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 第二章桃流胶病病害调查与分析 .流胶病是我国桃树栽培上最常见的病害之一,主要为害 桃 枝干,引起发病部位的树皮开裂产生胶状溢出物。该病能够严重削弱树势,导致果 实产量和品质下降,甚至造成桃树枯死。 为了掌握该病的发病情况以及不同桃树品种对该病的抗性,本文对华中农业大 学标本园的桃流胶病进行了病害调查,希望能对该病的流行规律和综合防治提供一 定的理论依据。 材料与方法 .田间发病情况调查 ..调查对象 对华中农业大学标本园内的桃树进行流胶病的病害调查,调查的桃树分三个 类 型:油桃、普通桃和蟠桃,不同类型桃树的品种如下: 油桃:中油号、中油号、曙光油桃、霞晖油桃、华光油桃、千年红、双喜 红、艳光油桃、早红宝石、早红珠、丹墨、早丰甜、艳阳天; 普通桃:春花、大久保、新川中岛、砂子早生、安农水密、美香、大珍宝赤 月、 庆丰、燕红、瑞霜红、中华寿桃、秋红、矮丽红、超早红; 蟠桃:早黄蟠、早露蟠、早油蟠。 ..调查分析方法 参考罗江会制定的桃流胶病病害分级表?,调查并统计发病 株数和发病情况,计算发病株率和病情指数。华中农业大学届硕士研究生学 位论文 表桃流胶病病害分级标准 级别 分级标准 全株正常,无流胶,无病斑 全树流胶点个,发病面积约占树干面积%以下 全树流胶点?个,发病面积约占树干面积%% 全树流胶点.个,发病面积约占树干面积/% 全树流胶点个及以上,发病面积约占树干面积%以上 发病株率气燃×?。。%;病情指数蠹翁雾妻翁燃× ..调查时间与频率 结合桃流胶病的发生情况,在不同的时间段内对华中农业大学标本园内的桃树 进行调查,其中年调查时间为年月日至年月日,由熊云、 周佳宏等人完成:年为年月日至年月日;年为 年月日至年月日,调查频率为每周一次。 .数据统计 根据调查的结果,统计不同品种的桃树流胶病发病率和病情指数,并进行分析。 结果与分析 .田间发病症状 桃流胶病主要危害桃树枝干,也可危害果实,其特征是引起发病部位产生胶状 溢出物,初期无色透明,之后变为红褐色,天气干燥时,胶体质地会变得坚硬,田 间症状表现见图。 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究。 图桃流胶病田间症状。:桃果实上的症状;、:枝干上的症状..: ;、:.田间 发病情况调查结果 .. 年调查结果 在.....期间,以华中农业大学标本园为调查对象,共调查了 次桃流胶病的发生情况,其中普通桃棵,油桃棵,蟠桃棵,总计 棵;发病率最低.%,最高达%,平均发病率为.%;病情指数最低为., 最高为.,平均病情指数.。从四月下旬到七月中旬,发病情况呈上升趋势, 七月下旬到九月上旬维持在较高水平。具体结果见图.与图.。 . . . 华中农业大学届硕士研究生学位论文 图 年各时间点调查的桃流胶病病情指数 . .. 年调查结果 在..?..期间,以中农业大学标本园为调查对象,共调查了 次桃树流胶病的发生情况。期间共调查了普通桃棵,油桃棵,蟠桃棵,总 计棵;发病率最低.%,最高达.%,平均发病率为.%;病情指数 最低为.,最高为.,平均病情指数.。从三月下旬开始到七月上旬,桃 流胶病整体发病情况逐步上升,在七月中下旬有所下降,随后保持在较高水 平。具 体结果见图?与图.。 图 年各时间点调查的桃流胶病发病率 . 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 图 年各时间点调查的桃流胶病病情指数 . .. 年调查结果 在..。.期间,以中农业大学标本园为调查对象,共调查了 次桃树流胶病的发生情况。期间共调查了普通桃棵,油桃棵,蟠桃棵, 总计棵;发病率最低,%,最高达.%,平均发病率为.%;病情指 数最低为.,最高为.,平均病情指数.。与前两年不同的是,在整个调 查周期中,从五月中旬开始到九月上旬,整体的发病情况呈缓慢下降趋势,月 到 月蟠桃上的发病率及病情指数有较大的起落。具体结果见图?与图.。 图 年各时间点调查的桃流胶病发病率. 华中农业大学届硕士研究生学位论 文 图 年各时间点调查的桃流胶病病情指数.?小结与讨论 为了初步探寻桃流胶病的发病与病害流行规律,我们从年到年连续 三年调查了华中农业大学标本园三种类型桃树的流胶病发病情况,统计了发 病率和 病隋指数。从表?与.可以看到,年桃流胶病的发病情况只是在很少几次 的调查时间点中病情指数超过了,如月号的普通桃和油桃的病情指数。但 年桃流胶病的整体发病率比较高,各个调查时间点基本上都在%以上,平均 发病率均在%以上。从桃树类型间的差异来看,油桃的病情指数平均为.,高 于普通桃和蟠桃的平均病情指数。 与年相比,年桃流胶病发病情况较轻,单次调查发病率最高为.%, 小于年的%,平均发病率为.%,远低于年的水平;平均病情指 数.,也低于年的.:年该病的发病情况加重,各调查点的平均 病情指数.,为三年的最高水平;平均发病率为.%,低于年的.%, 高于年的水平。 综合三年的数据显示,华中农业大学标本园桃流胶病年的发病情况最轻, 发病率最低时在%以下,最低病情指数为.,平均发病率和病情指数均为三年 中的最低水平。在三种类型桃树之间进行比较,发现蟠桃的发病率和病情指 数均低 于普通桃和油桃 本章对华中农业大学标本园年至年的桃流胶病发生隋况进行初步的 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 调查分析,但是对该病的流行性规律的探究仍然需要进行更多的数据调查, 如天气、 降雨、温度等气象数据,以进行气候因子的相关性分析。 华中农业大学届硕士研究生学位论文 第三章解淀粉芽孢杆菌对桃流胶病 拮抗效果的相关研究 目前,国内外基本没有对桃流胶病拮抗性内生细菌研究的相关报道。实验室 前 期从华农桃园中健康桃树的茎和叶中分离到了种内生细菌,其中树叶中分离 到 . 种细菌,通过与桃树流胶病菌可可毛色二孢 进行对峙培养,筛选出对桃树流胶病菌有拮抗效果的内生细菌菌株、、和, 经过进一步鉴定和属于芽孢杆菌属 .。 本章选用代表性拮抗内生细菌解淀粉芽孢杆菌进行进一步研究,首先测定了 的抗真菌谱,并通过枝条接种的方式,测定了对桃流胶病菌一的拮抗 效果;同时对的发酵滤液进行了温度和蛋白酶处理以及萃取分离等研究了其 理化 特性,并通过抗生素标记的方法对的内生性进行了验证。 材料与方法 试验材料 ..供试菌株 .:由华中农业 桃流胶病菌可可毛色二孢 大学园林学院李国怀教授惠赠图一,于培养基上培养。和保存?; 解淀粉芽孢杆菌 ,:实验室前期从健康桃树上分离 图.,于培养基上培养?和保存?。图 .和的菌株形态。:.::? .:; . 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 ..供试植物 供试植物为华中农业大学标本园内健康一年生桃树枝条。 ..培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ,:马铃薯去皮 , 。不添加琼脂即为液体培养 葡萄糖? ,.%的琼脂,加水至 。 基。高压湿热灭菌?, . 培养基: /生工生物上海有限公司, 调节为.。添加.%的琼脂即为固体培养基。 。 以上培养基均进行高压湿热灭菌?, ..酶和试剂盒 :北京康为世纪生物科技有限公司。 :北京全式金生物技术有限公司。 一凝胶回收试剂盒: ,,。 ..主要试剂 无水甲醇分析纯,色谱纯,国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇分析纯, 国药集团化学试剂有限公司;正丁醇分析纯,国药集团化学试剂有限公司;乙 酸乙酯分析纯,国药集团化学试剂有限公司;石油醚分析纯,天津市凯通化学 试剂有限公司;氯仿分析纯,国药集团化学试剂有限公司;四氯化碳分析纯, 国药集团化学试剂有限公司;蛋白酶,;苯甲基磺酰氟 ,,,;胃蛋白酶 ,,。 ..抗生素 利福平,:无水甲醇配制成 溶液,于一。保存,工 作浓度为/。 ..主要仪器 一高速冷冻离心机 美国公司 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器 华中农业大学届硕士研究生学位论文 试验方法 ..内生细菌的抗真菌谱测定 将供试菌株在固体培养基上划线培养。,,挑取的单菌落在 液体培养基中。,/摇培天之后,用高速冷冻离心机/,。 离心,取上清用细菌过滤器过滤,得到发酵液。将发酵液按%的比例加入到 培养基中,之后接种核盘菌、禾谷镰刀菌、桃褐腐病菌、稻瘟菌、灰葡萄孢 和胶 孢炭疽菌等种植物病原真菌用打孔器打取直径为 的菌丝块,接种针接种, 不加发酵液为对照,每处理次重复。每天观察生长情况,测定各种病原菌的菌 丝 生长速度,并拍照记录。 ..温度处理对的发酵滤液抑菌效果的影响 制取的发酵滤液,方法见..,将制得的的发酵液分别在不同的温度下 ?、?、?和?处理,处理后的发酵滤液按%例加入 中:将供试菌株.在新鲜培养基上活化?,用打孔器在培养基 边缘打取直径为 的茵丝块,用接种针接种到加入发酵液的培养基上 。条件下培养,设立空白对照和未经温度处理的发酵滤液对照,测量菌丝生长 速度并计算拮抗效果。 ..蛋白酶处理对的发酵滤液抑菌效果的影响 。 参照的方法,在 的发酵滤液巾加入蛋白酶. 终止反应, ,,,。水浴 后,用.斗 ,,然后加入 胃蛋白酶,,处理。。 处理后的发酵滤液按%例加入 ;接种活化的一, 。条件下培 养,设立空白对照和未经蛋白酶处理的发酵滤液对照,观察拮抗效果。 .. 发酵液对.致病的影响 首先,在室内检测了内生细菌的培养发酵液对桃树流胶病菌.致病 的影响。将在固体培养基上划线培养。,,挑取的单菌落在 液体培养基中。,/摇培天之后得到带菌的发酵液。活化一 菌株,方法见..。采取左右的一年生绿色幼嫩桃树枝条,去除叶片,仅留解淀 粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 顶端约片叶子以保证其活力,随后进行%酒精喷洒消毒备用。将处理过的桃 树枝条放在铺有吸水纸的盘内,用打孔器在近顶端约处刺伤后进行试验。试 验 中设置仅接种病菌.的对照、接种.后喷施不同浓度 的发酵液稀释倍和倍以及喷施不同浓度的发酵液后接种一 不同处理。处理后用保鲜膜密封后置于室温下保湿,每天测量病斑大小并拍 照。 ..浸泡菌液对.致病的影响 挑取的单菌落,接种到液体培养基中,,/摇培 得到的新鲜菌液。采取左右的一年生绿色幼嫩桃树枝条,去除叶片,仅留 顶端约片叶子以保证其活力,随后进行%酒精喷洒消毒,将消毒后的桃树枝 条浸泡到的菌液以及液体和水中,置于培养箱内培养。在浸泡一天和两 天后取出枝条,剪掉枝条下部,然后参考..进行一的刺伤接种试验。测 量病斑大小并拍照。 .. 注射桃树枝条对.致病的影响 挑取的单菌落,接种到液体培养基中,?,/摇培 得到的新鲜菌液。用注射器在健康桃树幼嫩枝条基部表皮下注射菌液,每根 枝条注射菌液。在注射、和之后分别将枝条采回,采用..中的方 法接种.打孔器刺伤,保湿培养,观察发病情况。 .. 发酵液的有机萃取 为了分离发酵液中拮抗一的物质,需要选用合适的有机萃取剂对发 酵液进行萃取。 挑取的单菌落,在液体培养基中摇培?,/后,在 /, 条件下离心,收集上清液,?灭菌后得到发酵液。 参照等的方法,取份 的发酵滤液,分别用等体积的 石油醚、四氯化碳、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿萃取次,将所得的有机相在真 空旋 转蒸发仪中旋蒸.。后用无菌水稀释至原浓度,水相的产物灭菌后各按% 比例加入到培养基中,接种一测定发酵滤液有机萃取各组分对 一的抑菌效果,测定方法见..。 华中农业大学届硕士研究生学位论文 .. 的内生性鉴定 对的内生性进行验证,是利用其进行桃流胶病生物防治的研究基础。本节通 过抗生素标记的方法获得一定抗性的菌株,注射到桃树实生苗上,一段时间 后从 移栽的桃树苗不同部位分离标记的内生菌,检测其在桃树中的定殖情况。 ... 的利福平,标记 利用利福平处理菌株,并逐渐提高处理浓度,诱导其产生抗性。制 备了含./、 /、 /、 /、 //利福平的平 板,由低浓度到高浓度逐步划线接种进行筛选标记,以得到在 /利福平浓 度下的平板上正常生长的抗性菌株。 ...抗性菌株的注射与桃树实生苗的移栽 将获得的利福平标记的菌株挑取单菌落,接种到液体培养基中 。,/条件下摇培,得到菌液。用注射器将菌液注射到桃树实生 苗茎干部位的韧皮部组织中,每株,共注射株;同时,注射未经利福平标记 的菌液到株桃树实生苗中。 在冬季桃树实生苗的休眠期将注射过的苗木以及部分健康阴性对照苗木进 行移 栽。 ...利福平标记的菌株的分离 在苗木移栽之后的个月,从注射的桃树苗以及健康的桃树苗不同部位根、 茎、叶采集样本,进行标记的菌株的分离。分离方法如下:将采集的样本清洗 干净,叶片剪成..大小的片状,根和茎剪成约长度的小段,用% 的酒精消毒;然后置于无菌水中清洗;将处理过后的组织样本置于 / 利福平浓度的平板以及不含抗生素的普通平板上,以上操作在无菌操作台上 进行。?分离培养。 共设置种分离处理:注射 /利福平标记的菌株的样本的分离;注射 未经抗生素标记的菌株的样本的分离;未注射的样本的分离。 ...分离菌株的划线 将在 /利福平浓度的平板样本组织周围分离筛选出的细菌进一步划 线培养,用接种环划线到新的 /利福平浓度的平板上,。培养,观察 生长情况。解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 ...分离菌株的鉴定 将分离的细菌挑取单菌落,接种到液体培养基中,。,/条 件下摇培,得到新鲜的菌液。 的扩增与纯化 以新鲜菌液为模版,使用 北京康为世纪生物科技有限公司 扩增所分离的细菌的,使用方法参见说明书。引物为通用引物和 ,体系。 上游片段引物: :‘订托配’ 下游片段引物: :? ’.’ .间隔区序列的扩增与纯化 以新鲜菌液为模版,使用 进行扩增所分离的 细菌的.间隔区序列,使用方法参见说明书。引物为通用引物和, 体系。 .间隔区序列上游片段引物: :‘.订’.。 .间隔区序列下游片段引物: :’..’ 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳电压下电泳 ,染色后照相,同 凝胶回收试剂盒说明书,得 时将扩增片段电泳切胶回收,方法参见 到纯化的.间隔区序列片段。 回收片段测序和比对 将扩增到的不同细菌和.间隔区序列送交上海桑尼生物科 技有限公司测序,得到的序列结果在上进行比对,对分离的细菌进行鉴定。 结果与分析 . 的抗真菌谱测定 检测了的发酵滤液对核盘菌、禾谷镰刀菌、桃褐腐病菌、稻瘟菌、灰葡萄孢 华中农业大学届硕士研究生学位论文 和胶孢炭疽菌等种植物病原真菌的拮抗效果,接种病原真菌后第四天,发现 发 酵滤液能有效抑制多种植物病原真菌,特别是桃褐腐病菌和稻瘟菌的生长, 对禾谷 镰刀菌的抑制效果不明显图.,测定各种真菌的菌丝生长速度发现,受到抑制 的真菌菌丝生长速度明显下降图.。试验结果表明内生细菌可能是一种广谱 的拮抗性内生菌,其应用前景和范围有望得到进一步的拓展。 囵固囵囤囵囵 % 滤液 囵囵图固囵囫 禾谷?刀苗 槐幅扁扁苗 胶甩发疽曹 稻疆菌 拔盘苗 灰蕾聋孢 图 发酵滤液对多种真菌的抑菌效果, ’ . ,;/ %造液女鲤二 , 一,倒心半酬刈粕广~ ?,?少?? 图 发酵滤液处理后的真菌菌丝生长速度. .温度以及蛋白酶处理对的发酵滤液抑菌效果的影响 为了研究的发酵滤液的理化性质,我们将高温或蛋白酶处理后的发酵滤 液按%例加入中,接种一,天后拮抗效果如图?所示,并测 定了.的菌丝生长速度,发现对照无明显差异图。结果表明高温 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 或蛋白酶处理对发酵液的拮抗作用效果均无明显影响,说明起拮抗作用的物 质热稳 定性高,而且不是蛋白质,或复合物的组分不完全为蛋白质。 . 要醚硝半刊潮粗 图高温和蛋白酶处理后发酵滤液对一生长的影响。 :.生长情况,;:菌丝生长速度 .. :: .;: . 发酵液对瓜忸.致病的影响 为了进一步确定内生细菌对桃流胶病的防治潜能,我们检测了发酵液对 桃流胶病菌.在桃树枝条上致病的影响。结果发现在室内进行桃树枝条的刺 伤接种处理后第三天,各个处理之间出现了发病情况和程度上的差异,发酵 液对 流胶病菌在桃一年生枝条上的致病性有明显的抑制作用,其中发酵液倍稀释 的效 果好于倍稀释,而先用发酵液处理后再接种病菌的效果要好于接种后再 用发酵液处理图?。 接种后第六天,各个处理的发病程度加重但整体趋势与接种后第三天一致图 ,测定了发病枝条的病斑长度图,接种.的枝条病斑长度超过 ,而发酵液处理后的枝条病斑长度在左右,说明发酵液能有效抑制 一的致病能力;而且先喷施发酵液效果要好于先接种一的处理,表明 发酵液中细菌可能通过刺伤伤口进入枝条,从而抑制.的致病。 华中农业大学届硕士研究生学位论文 匹玉盈墨】圈 先接种 后接种 × 隆 璧. 睦?二;.. 睦 × 晒 涵网邗翟 刺伤对照 图 发酵液处理接种后第天发病情况. , 图 发酵液处理接种后第天发病情况。 :枝条症状表现;:枝条病斑长度 逛. ,. : ;: .浸泡菌液对毋.致病的影响 为了验证能否在离体的桃树枝条上定殖从而抑制.的致病,我们将 枝条浸泡在的菌液中一段时间后,观察浸泡过菌液的枝条在发病上与对照浸 水、之间的区别。发现浸泡后的枝条发病最严重,而浸泡菌液两天后的 枝条发病情况比浸水的枝条稍稍严重图试验结果表明在离体条件下,无 法通过浸泡的方式在桃树枝条中定殖并发挥对一的拮抗作用。 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 浸 浸 浸泡 浸泡 浸水 ??如??????? 图浸泡菌液后枝条接种.病斑长度。 :浸泡;:浸泡.: ;: . 注射桃树枝条对.致病的影响 为了进一步验证是否能在田间桃树枝条上定殖,对一产生拮抗效果, 我们将的菌液注射到健康的田间桃树枝条中,在注射不同时间后将枝条采回, 通 过打孔器刺伤的方式接种.,并设置对照。发现注射后再接种., 发病枝条在病斑的长度和流胶的严重程度上均有所减少降低,在注射菌液之 后接种.,前期发病会有所减轻,但在第天时两者发表程度基本没有差异, 而在注射菌液及之后接种.,在观察周期中注射处理发病程度明 显降低图,?。结果说明注射菌液一定时间后对桃树流胶病具有一定的防 华中农业大学届硕士研究生学位论文 治效果,而注射时间越长,在桃树枝条上定殖情况越好,对.的致病抑制 效果也越好。该实验也在一定程度上验证了的内生性。 ;~一 』,卜. 图 注射桃树枝条后不同时间接种发病结果, ., ? ? 往射 ? ? 来注射 铀 ? ? ? 如 ? ? ? ? ? ? 昌越半磺婆 ? ? 图一 注射桃树枝条后不同时间接种一发病程度,. 一, . 发酵液有机萃取剂的筛选 为了分离发酵液中的拮抗物质,首先需要筛选出合适的有机萃取溶剂。我们 使用石油醚、四氯化碳、正丁醇、乙酸乙酯和氯仿五种有机萃取剂对发酵液 进行 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 萃取,结果表明四氯化碳对发酵液中有效成分的萃取效果比较好图.,可 以作为合适的萃取剂进行下一步工作,值得注意的是而正丁醇和乙酸乙酯溶 剂本身 对.具有很好的拮抗效果。 氯甲烷 “油醚 乙艘乙醇 四氯化碳 一可?越制半划潮龌 ; 匝?一 丁聪 一?酉蔓、删耍圈慷图~幽 歹爹??爹。 水牛日静相 图一不同有机溶剂对发酵液的萃取效果 :的生长情况;.的菌丝生长速度.?: . 内生性的鉴定 .. 的利福平,标记 利用利福平处理菌株,并逐渐提高处理浓度,诱导其产生抗性。成 功对进行了标记,得到了在利福平工作浓度 /下能够正常生长的菌 株一,其菌落形态见图一。 华中农业大学届硕士研究生学位论文 圃圜 囵口 一 图.标记菌株及在平板上生长情况. .利福平标记的菌株的分离 将获得的抗性菌株.注射桃树枝条个月之后,采用常规的细菌分离方法 从注射了菌株的桃树苗根、枝和叶等不同部位分离出了在/利福平浓 度的平板上能够生长的细菌菌株。 在普通平板上,注射 】菌株的样本和注射菌株的样本以及未注射 的样本周围均可见大量细菌长出图.,从菌落形态来看,为多种不同的细菌; 而在/利福平浓度的平板上,只有注射菌株的样本周围长出细菌菌 落图.,说明长出的细菌很可能为。 纩飞『飞 窆刎么’。一 『习网『飞 凶幽么 纩冈形冈阪蕊 涵幽渤 注射 注射. 图? 平板上的细菌分离情况 . 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 根 枝 叶 注射 注射. 图. 平板上的细菌分离情况 . 间隔区序列的扩增 .分离菌株划线与及. 将..中从注射了.的桃树苗不同部位分离的细菌菌株根部分离的细菌 菌株.:枝干部分离的菌株一;叶片上分离的菌株划线培养,在浓度为 /利福平平板上能够正常生长,培养后的菌落形态与.菌株相似图 .。 . 平板,。 图分离细菌的菌落形态,/.?,/ . 扩增分离到的细菌菌株.、.和的,凝胶电泳结果显 示在?之间扩增到约的目标片段图.。华中农业大学届硕士研究生学位论文? 图.分离菌株的扩增。 泳道:;泳道:标记的;泳道:;泳道:.:泳道: . .: : :; ; :; :; 扩增分离到的细菌菌株.、.和的.间隔区序列,凝 胶电泳结果显示在之间扩增到约的目标片段图.。 图?分离菌株间隔区序列的扩增。 泳道:;泳道:标记的:泳道:.;泳道:.;泳道: . . : : ; :; :一; :; 解淀粉芽孢杆菌防治桃流胶病的研究 .. 和.间隔区序列的测序比对结果 将扩增到的以及回收的.间隔区序列片段送到生物公司 上海桑尼生物科技有限公司测序,测序序列在网站上进行比对。分离到 的三个细菌菌株.、.和的序列比对结果一致,均为芽孢杆菌 属细菌图?,这一结果与的的比对结果相一致;.间 隔区序列比对结果与一样,为解淀粉芽孢杆菌缸 图 ?。表明所分离的细菌为标记的,从而对的内生性进行了验证。 兰竺锄吖?%. % 口垫??四 ?;?也目?盟%. % 口 %. % 口 . %. % 口. %. % 口%. % 图.分离菌株的比对结果 . 呻? 帆虻帆:洲怕酣 %. %.. %. % ::’: . , %% % % . %% 旦堡 ?丑垒?垡皇旦目目堕皿垦皇型旦旦璺盟皇堕卫 %% . 图埔分离菌株的间隔区序列比对结果. 小结与讨论 为了寻找对桃流胶病进行有效防治的方法,我们利用实验室前期分离到的内 生 细菌对桃流胶病进行了生物防治相关的研究。通过抗生素标记的方式对的内 生性进行了鉴定;测定了对几种病原真菌的拮抗效果;通过室内枝条接种的 方式 测定了发酵滤液对致病的影响,并通过枝条注射接种的方法对室外条 件下对一的拮抗效果进行了检测;对的发