G蛋白偶联受体在昆虫中作用机理及功能的研究进展

选题原因：       我在学校SRT项目中做的课题是“吡蚜酮作用于褐飞虱5-羟色胺受体的药理研究”，而且在实验室也进行的SK和TK神经肽受体的克隆这两个神经肽受体就属于G蛋白偶联受体。G蛋白偶联受体参与众多生理过程，如：感光（视紫红质是一大类可以感光的G蛋白偶联受体），嗅觉（可以感知气味分子和费洛蒙），行为和情绪的调节（好斗和侵略行为）等。对G蛋白偶联受体进行生物学研究有利于了解昆虫行为，以G蛋白偶联受体受体为靶标，新型特异性杀虫剂提供理论基础。从而达到控制害虫的作用。 G蛋白偶联受体在昆虫中作用机理及功能的研究进展 蔡晓艺 吴顺凡 摘要：嗅觉受体，多巴胺受体，5- 羟色胺都属于G蛋白偶联受体，昆虫的嗅觉对昆虫的栖息地选择、觅食、群集、趋避、繁殖以及信息传递等行为具有重要的影响。嗅觉受体(olfactory receptors, Ors)是G 蛋白偶联受体( G protein-coupled receptor)的一种, 是嗅觉系统的关键成分。多巴胺调控昆虫的交配、发育、嗅觉以及运动行为等， 特别对 DAＲs 的信号转导、生理以及药理学功能。TK对于果蝇的攻击行为，求爱行为有明显的影响。CK对于昆虫的取食有明显的促进作用。本文主要综述了多巴胺在昆虫中的调控、分布及所参与的生理功能， 如多巴胺调控昆虫的交配、发育、嗅觉以及运动行为等， 特别对 DAＲs 的信号转导、生理功能以及药理学等方面进行了详细评述。5-HT 通过结合特异性的 G 蛋白偶联受体在昆虫体内发挥不同的神经调控作用，调节昆虫主要的行为活动， 比如取食、 生物钟、 聚集、 学习和记忆等。不同昆虫 5-HT 受体药理学性质存在差异，将为以 5-HT 受体为靶标，设计新型特异性杀虫剂提供理论基础。 关键词：G 蛋白偶联受体，昆虫嗅觉神经，昆虫嗅觉，药理学 Abstract：olfactory receptors（Ors），dopamine receptors（ DAＲs），5-hydroxytryptamine（5-HT）are belong to G protein-coupled receptors, The olfaction has many important effects on insect behavior, including habitat choosing , food hunting, gathering, tropism , reproduction , signal communication , etc . Olfactory receptor ( OR), as a kind of G protein-coupled receptors , is a key component of the olfactory system . In this review,we summarized the current knowledge on the modulation of DA,its distribution in nervous and non-nervous tissues,and its physiological functions in insects，such as its involvement in modulating insect mating， development， olfaction and locomotion． Especially， the recent progress about signal transduction，physiological roles and pharmacological properties of insect dopamine receptors was reviewed in detail．5-HT plays various important physiological roles in insects through specific G protein-coupled receptors， such as feeding,circadian behavior,aggregation,learning and memory．The pharmacological differences of 5-HT receptors from different insects will provide fundamental basis for designing and developing new specific insecticides for pest management． 前言：为了感知所处环境的物理化学性质, 生物体进化出了高度特异性的感觉系统 。这些系统将感觉器官受到的刺激转化成为各种信号 ,进而直接或间接 地影响着个体生活的方方面面 ,如行为 、生理和代谢等。随着对哺乳动物嗅觉的分子研究进一步深入 ,以及对其机理的探索所取得的突破 ,昆虫嗅觉的分 子研究迅速发展起来 。嗅觉受体( olfactory receptors ,Ors) 作为嗅觉系统的关键成分之一 ,对嗅觉受体的研究是认识昆虫化学信号的分子识别机制的重要环节[1]。多巴胺( dopamine， DA) 是一种广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物体内的儿茶酚胺神经递(catecholamine neurotransmitter) 。在昆虫体内， DA 调控着昆虫的学习与记忆、运动、抉择以及飞蝗从散居型到群居型的型变等[2]。5-羟色胺( 5-hydroxytryp tamine，5-HT) ， 又名血清素( Serotonin) ，是广泛分布于脊椎动物和非脊椎动的中枢神经系统和外围组织中的单胺类神经递质， 调控许多关键生理过程，例如痛觉调制、 感觉运动、 心血管功能以及呼吸、 睡眠、 食欲、 摄食行为与认知功能等。5-HT 通过启动不同的 5-HT 受体亚型偶联不同的信使传导从而产生不同的药理作用，5-HT受体分型复杂[3]。 90 年代初期, 在脊椎动物褐家鼠Rattus norvegicus 中首先发现了嗅觉基因家族, 这一研究获得 2004 年的诺贝尔生理学或医学奖;接着在线虫 Caenorhabditis elegans 中也发现了这类基因, 昆虫嗅觉传导的分子研究也在同一时期发展起来 。首先发现气味分子能诱导一种位于嗅觉细胞膜上具有电化学转换功能的第二信使,在嗅觉感受细胞中引出了一条G 蛋白介导的信号流。同时, 在黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 体内发现了类似 G蛋白偶联受体的神经肽受体以及糖蛋白激素受体,这些受体的基因被克隆并异源表达,在研究东亚飞蝗的神经肽时也发现了传递胺 、肽和激素等物质刺激信号的 G 蛋白偶联受体。在完整的触角和触角匀浆中, 许多实验表明诸如肌醇三磷酸、环磷腺苷和环磷鸟苷等依赖信息素作用的第二信使的存在, 暗示嗅觉受体是 G蛋白偶联家族的成员。随着果蝇基因组的计划的实施 ,学者们明确了 19 种果蝇嗅觉基因。伴随果蝇基因组测序的完成 ,发现的嗅觉受体基因的个数也增加到了 62 个。DA， 首次于 1910 年由英国伦敦惠康实验室的科学家 George Barger 和 James Ewens 通过左旋多巴( L-DOPA) 合成。直到 1957 年， Arvid Carlsson 等( 1957) 才发现其独立于去肾上腺素和肾上腺素之外， 作为一种神经递质在动物体内扮演着特殊的重要角色， 他也因此获得了 2000 年诺贝尔生理学或医学奖5-HT 最 早 于 1946 年 被Erspamer 发现，Erspamer 从肠道提取一种可引起平滑肌收缩的物质时， 发现一种源于肠道 Kultschitzky细胞的血清血管收缩剂和体液性因子， 因此将其命名为小肠胺( enteramine)。此后，Ｒapport 等( 1948) 为寻求导致高血压的体液性因子时，从血清中分离到一种缩血管物质，并命名为血清素 ( serotonin ) 。 该 物 质 后 被 Erspamer 和 Asero( 1952) 通过化学鉴定确定为5-HT。近年来，由于5-HT 在昆虫生理功能中的重要性， 越来越多的人研究昆虫 体 内 5-HT， 特 别 是 对 模 式 昆 虫 黑 腹 果 蝇（Drosophila melanogaster） 和西方蜜蜂 （Apis mellifera）。 1.三种G蛋白偶联受体的调控 表达相同嗅觉受体的神经元汇集到触角叶中相同的神经纤维球或者功能性处理单位中。这些神经元最终将嗅觉信号传导到脑部的触角叶结构, 从而在昆虫的脑部形成关于该气味分子的抽象信息。嗅觉感受器的表皮上分布有许多小孔, 环境中的气味分子能穿过这些小孔扩散到嗅觉感受器的淋巴液中,通过与水溶性的气味结合蛋白形成复合物或直接作用到嗅觉受体上[4]。DA 作为信使物质， 其在生物体内的浓度必须受到严格的调控， 而首要的调控手段就是控制其合成速率。昆虫 DA 的合成底物也是氨基酸———酪氨酸。酪氨酸羟化酶是 DA 合成的限速酶， L-DOPA 进一步在多巴脱羧酶作用下生成 DA[6]。氨基酸色氨酸是 5-HT 的生物合成前体，在色氨酸羟化酶的作用下生成 5-羟色氨酸，然后在 5-羟色氨酸脱羧酶的作用下， 脱羧基生成 5-HT。色氨酸羟化酶是 5-HT 合成过程中的限速酶， 黑腹果蝇中色氨酸羟化酶由两个基 因 编 码， 即 dTPH 和 dTＲH。两个基因的产物色氨酸羟化酶在体外都有活性，但 dTPH 在非神经组织中表达，dTＲH 基因在神经组织中表达[7]。AADC 在中枢神经系统中的 5-HT 和多巴胺神经元中都有表达， 不仅参与 5-HT 的合成， 也参与多巴胺的合成。 2.三种G蛋白偶联受体的分布 在果蝇中, 嗅觉感受器位于触角的第3 节以及口器的下颚须上 。每个细胞在树突部的细胞膜上能特异性表达相应的嗅觉受体蛋白。这些神经细胞的胞体位于触角角质表皮的下方, 而树突端则延伸到嗅觉感受器, 并浸没在表皮细胞分泌的富含钾离子和蛋白质的淋巴液内[8]。DA 及其受体在果蝇脑部的中央复合体内有大量分布， 而该区域控制着果蝇的运动行为。DA 的分布与 TH 基因的表达有直接关系， TH 是 DA 合成的限速酶， 利用 TH-GAL4 系统构建的转基因果蝇， 可将 TH 在胚胎、幼虫中枢神经系统和成虫脑 中 的 表 达 完 全 勾 勒 出 来。此外， 外周神经中也被报道有DA 的分布， 并可能释放进入血淋巴系统中进行循环。不同种类的昆虫体内的 DA 含量也不同， 且受外界条件的 影 响 较 大。如蜜蜂的幼虫、蛹和成虫的脑部都有 DA， 且主要分布在前脑， 其代谢产物 N-乙酰多巴 胺 则 在 视 叶 和 前 脑 都 有 分 布[9]。5-HT 在昆虫中枢神经系统和外周神经系统中都有分布。腹神经索中很多的 5-HT 神经元是中间神经元。在感觉神经元、 咽下神经节、 中间神经元、 神 经 分 泌 细 胞等部位都有 5-HT 的分布。对厩螫蝇5-HT 的分布研究发现， 很多对 5-HT 有免疫活性的物质在成虫的 CNS 和胸腹部神经节中都有发现。Haselton 等确定了 5-HT 存在雌马虻 Tabanus nigrovittatus 的 CNS中肠中。Siju 等发现 5-HT 存在于埃及伊蚊Aedes aegypti 的中央和外周化学感受系统中，在主要的嗅觉神经纤维和触角中都有 5-HT 的免疫活性物质存在。5-HT 在昆虫体内的分布有一定的特点， CNS 分布很多，从幼虫期到蛹期， 头部 5-HT 含量升高。成虫期 5-HT 含量也会随着日龄的增加而改变。对黑腹果蝇各发育阶段和成熟后的神经系统中的 5-HT 神经元进行跟踪实验， 发现幼虫期约 84 个神经元，成虫期多于 100 个。用 5-HT 单抗在黑腹果蝇成虫单个脑中鉴定出了 38 ～ 41 个 5-HT 神经元， 其中一些已经被 Vallés 和 White描述， 主要是咽下神经元和腹部神经元。[10]在黑腹果蝇幼虫和成虫的脑中，5-HT 免疫反应的神经元与主要昼夜节律神经元的树突和背侧末端都相距很近。 3.三种G蛋白偶联受体的功能 嗅觉受体蛋白在异源系统中的表达表现出高度的复杂性,在转基因表达时发现 , 在异源生物系统中合成的大部分受体分子并不被运输到细胞质膜上 , 而留在了内质网中,这可能因为一些未知的辅助分子丢失了。通过在触角中过表达受体 Or43a, Stärtkuhl 和 Kettler( 2001)第一次在果蝇中测定了该受体的功能。之后, 又建立突变的缺乏内源嗅觉受体的神经元, 用这种“空白神经元”作为活体表达系统, 将通过原位杂交研究发现的 29 种受体在空白神经元中表达并检测分析。研究果蝇感知二氧化碳的味觉受体 Gr21a和 Gr63a 时, 采用了缺失 Gr63a 的突变型个体。对果蝇 Gr28 基因的研究表明其在感觉 神 经 和 中 枢 神 经 中 非 典 型 表 达, 除识别外源气味分子外, 可能还参与内源配体的识别。嗅觉受体的信号转导作用的初期包括三种类型的蛋白依次相互作用, 即嗅觉受体、G 蛋白和一些效应酶类。催化第二信使分子( 如 cAMP 等) 形成的效应物打开离子通道 ,并使嗅觉神经元细胞膜去极化,进而产生受体感应电势 。这种效应物现在发现是磷脂酶 C, 能够催化 IP3 和甘油二酯中的磷脂酰肌醇磷酸氢盐水解 , 这些化合物各自的角色还没有得到彻 底阐 明。Sato 等( 2008)最近的研究表明昆虫 Ors 包含一个新的种类 ———由配体激活的非选择性阳离子通道通过膜外向外式膜片钳技术, 在爪蟾卵母细胞和 HEK293T 细胞膜表达昆虫 OR 复合物 ,证明其本身具有通道活性 ,且形成的配体门控离子通道可能是昆虫获得的对气味环境反应的一个独特策略。在这些研究的基础上, 对昆虫嗅觉受体神经元中早期信号传递的模型也粗略地建立起来。目前 ,对蛾类的性信息素受体的功能研究比较深入。蛾类的性信息素一般是 2 到 3 种包含 12 到16 个碳原子的碳水化合物分子的混合物 ,雄蛾的信息素感受系统专门识别雌蛾散发的极微量的这类信息素[11]。 DA 在昆虫体内所发挥的生理作用， 主要是通过结合其相应的受体来完成的。果蝇的 DmDOP1和 DmDOP2( DAMB) 基因在其脑部的蘑菇体中有表达， 并被认为参与了果蝇记忆的形成， 如果蝇对嗅觉气味的记忆以及对食欲的控制等。有研究表明， 激活 DA 神经元可引起果蝇的睡眠减少， 然而当失去了 DmDOP1 受体的表达后， 这种效应便受到了阻断， 恢复该受体表达所做的补救实验则显示 DA 引起的睡眠减少再次显现。因此 DA 很可能是通过 DmDOP1 受体， 进而激活cAMP 信号及下游的 CＲEB来完成对睡眠的调控的; 果蝇的 DmDOP3 参与了对果蝇爬行行为的调控， 两类受体还参与调控果蝇体内保幼激素和蜕皮激素的水平。蜜蜂的 AmDOP1 基因也在蘑菇体和其他大脑区域包括触觉叶和视叶中表达， 蜜蜂的 AmDOP2 被报道参与了蜜蜂的运动行为，蜜蜂AmDOP3则被报 道 受 蜂王信息素的主要成分HVA激活，并引起脑部 cAMP 变化，引起记忆的产生[12]。 5-HT 的功能主要是通过其受体实现的， 对昆虫5-HT 及其受体在生理和行为上的功能的了解主要是依靠药理学实验， 但是随着遗传学和分子生物学技术的不断进步， 通过基因敲除来研究 5-HT 及其受体的功能越来越常见。冈比亚按蚊 Aedes aegypti的 5-HT7 受体主要在微气管细胞和后肠中表达，5-HT 在呼吸过程中起了作用， 同时在利尿过程中，5-HT7 受 体 可 能 协 助 肠 道 对 5-HT 作 出 反 应。西方蜜蜂 5-HT 参与了趋光行为，其 5-HT1A受体在脑部参与视觉信息处理的部位高表达， 并且通过体内药理学实验证明 5-HT1A对单头蜜蜂光反应行为有很大的影响， 从基因表达水平到行为过程证明 5-HT1A 参与调节蜜蜂对光的反应过程。黑腹果蝇 5-HT1A参与调控睡眠过程，通过对黑腹果蝇 3 种 5-HT受体突变体基线睡眠值进行分析，发现 d5-HT1A果蝇有短暂和片段睡眠现象， 该现象可以通过成虫脑部蘑菇体部位表达 5-HT1A而得到补救。而 d5-HT1B和 d5-HT2A对果蝇基线睡眠值没有影响。通过药理学和遗传学的方法增加5-HT 的表达量，能促进野生型果蝇的睡眠。虽然 5-HT1B不参与调控果蝇睡眠，但是前面已经提到果蝇 5-HT1B受体调控昼夜节律。同样通过遗传学和药理学的方法， 利用非选择性 5-HT 受体拮抗剂 metitepine 对黑腹果蝇 5 种 5-HT 受 体 突 变 体取 食 的 影 响 分析，发现5-HT2A是metitepine抑制取食唯一需要的受体[13]。在所有的昆虫中， 黑腹果蝇5-HT 及其受体的功能相对研究的比较多。目前，只有 5-HT2B未报道与其相关的功能。总体而言，这方面还需要大量深入的研究[13]。 6.小结与展望     随着昆虫基因组序列库数量的不断扩增 ,更多物种的嗅觉受体被将发现鉴定出来。当然 ,随着研究的深入,学者们也不断遇到各种难点和问题 ,如昆虫的嗅觉受体的结构越发表现出一种与典型的 G 蛋白偶联受体反向的跨膜分布, 这 导致了研究者们必须换一个角度来分析这种新结构的功能 。另外, 嗅觉系统中各种新化合物和蛋白的发现 ,显著扩充了嗅觉途径网络的宽度 ,使得寻找嗅觉系统的新成分以及了解如此多的化合物与嗅觉受体之间的关系成为一个复杂的课题。再者, 环境中各种化合物对嗅觉受体的作用还没有直观地展现出来,而嗅觉受体的结晶体获得则有待相关实验技术水平的进一步提高。     昆虫 DAＲs 的研究， 未来将可能主要集中于以下几个方面: ( 1) 在昆虫基因组中挖掘新的 DAＲs受体; ( 2) 寻找不同种类昆虫特异性的 DAＲs 受体，( 3) 通过结构生物学等手段，比较研究脊椎动物和无脊椎动物类型 DAＲs 药理学性质差异的的具体机制; ( 4) 对昆虫体内 DAＲs 参与各种生理反应的进一步发掘等。对昆虫体内 DA 及 DAＲs 的生理与药理学研究， 也将有助于我们更深入地理解昆虫的各种行为机制及开发以 DAＲs 为靶标的杀虫剂用于害虫防治。     目前昆虫体内鉴定出来的 5-HT 受体都是 GPCＲ 类型。[14]昆虫和哺乳动物对药物反应、 行为以及基因反应的相似性，有可能使某些昆虫如果蝇和蜜蜂作为研究人类某些疾病的工具， 从而可以快速、 高通量、低成本的去了解 CNS 中 5-HT 的功能。最近， 人 的 5-HT1B和 5-HT2B受体的晶体结构已有报道， 这可以帮助我们更深入地研究 5-HT 这类受体的结构特点，从而为将来设计和开发杀虫剂奠定了基础。 昆虫有许多行为是多个神经肽控制，而一种神经肽可能控制多种行为，这也为研究造成一定的难度。 参考文献： [1] 龚中军，周文武，祝增荣，程家安. 昆虫嗅觉受体的研究进展. 昆虫学报，2008，51(7):761-768. 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