广州市2006年登革病毒5_末端非编码区基因分析

广州市2006年登革病毒5_末端非编码区基因分析 Sequence analysis of dengue virus isolated in Guangzhou in 2006. J IANG Li - yun , WU Ye - jian , L IU Yuan , et al . ( )Guangzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention , Guangzhou 510080 , Guangdong , P. R. China Abstract :Objective To analyze the gene of 5′un - scripted region of dengue virus isolated in Guangzhou in 2006. Methods A pair of primers aiming at the 5′un - scripted region were designed. The positive products were sequencely analyzed by RT - PCR and then phylogenetic tree was drawn. Results There 78 serum samples were tested and 23 were positive . Four representative se2 quences were identified. Conclusion There is no evidence show that dengue virus has been localized in Guangzhou. The virus seems to be brought back by travelers from other countries. Thus the rapidly discover and control sources of infection is of fundamental importance for control of dengue fever. Key words :Dengue Virus ; Gene ; Sequence analysis () 登革热是流行于热带和亚热带地区的一种虫媒传染病 ,由 ,QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen挖胶回收 , Eppendorf Mas2 增 登革病毒所致 。在我国主要流行于广东 、海南 、广西 、福建等地 tercycler 梯度 PCR 仪 ,Bio 电泳仪 。 区 ,通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播 。广州曾在 2002 年发生登 引 物 序 列 D1 ATATGCTGAAACGCGCGAGAAA , D2 113 革热大流行 ,而后几年则仅有散发病例 。2006 年 ,广州地区发 GACATTGACTGTTGGTGCAA。 生小规模暴发 ,通过临床确诊或实验室确诊的登革热病人共有 () 114 RT - PCR 用 QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen提取登革 774 例 。 病毒 RNA ,加入引物 D1 和 D2 ,用 Ta KaRa One Step RNA PCR Kit 登革病毒基因组可分为 5′末端非编码区 、病毒结构蛋白编 进行 RT - PCR 扩 增 , 反 应 条 件 42 ? 1h , 94 ? 5min , 94 ? 30s , 码区 、病毒非结构蛋白编码区 ,以及 3′末端非编码区 4 个部分 。 55 ? 45s ,72 ? 3min ,循环 30 次 , 72 ? 7min 。 其中 ,5′与 3′末端非编码区各有一保守序列 ,且反向互补 ,病毒 115 电泳及测序 将 RT - PCR 反应产物加入 1 %的琼脂糖凝 RNA 分子的环化部分可能作为病毒 RNA 酶的识别部位 ,使该 胶中电泳 , EB 染色后在紫外光下观察 ,阳性条带为 500bp 。 酶同时与 RNA 分子的 5′和 3′末端结合 ,用于转录正链和负链 116 基因序列同源性分析及基因树绘制 将得到的样品测序 结RNA 。5′末端非编码区 的 缺 失 将 导 致 病 毒 复 制 受 抑 制 。在 本 果在 Bio Edit 中相互比较 ,在 GenBank 中搜索相似序列 ,并与 标实验中 ,针对 5′非编码区设计通用引物 D1 和 D2 ,从病人血清 准 株 Thai01 , Myanmar01 , Cambodia98 , ZJ 01 , J apan88 , westpac , 中提取病毒 RNA ,进行 RT - PCR ,并对产物测序 ,将序列进行比 Arg00 ,Par00 ,Brazil97 ,singapore , GZ02 , GZ80 绘制基因树 。 较 ,绘制基因树 。 2 结果 1 材料与方法 2006 年期间 ,实验室用 RT - PCR 检测不同病人血清标本 111 标本 广州地区 2006 年 3,10 月登革热高发期间 ,采自 78 份 ,检测出阳性 23 份 ,阳性率为 29149 % 。其中 ,1 份为登革 登革热流行现场以及传染病医院送检的疑似病人血清标本 ,共 ( ) 热 III 型 GZ06/ 71,在 GenBank 中搜索发现 , GZ06/ 71 的序列与 计 78 份 。 () 112 材料和仪器 QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen提取登革 热病毒 RNA , Ta KaRa One Step RNA PCR Kit 进 行 RT - PCR 扩 2004 年印度尼西亚分离得到的序列最为相近 ,相似率为 98 % 。 登革病毒 ?型株 22 份 ,在 Bio Edit 中比较得出 3 种代序列 ,分 ) ( ) ( ( 别标 号 为 GZ06/ 1707 8 株 , GZ06/ 2620 13 株 , GZ06/ 4525 1 ()Ξ 基金项目 :广州市医药卫生科技项目重点项目基金资助 2006 - ZDi - 10 作者单位 :广州市疾病预防控制中心 ,广东 广州 5100801 () 作者简介 :蒋力云 1980,,女 ,汉族 ,四川成都人 ,医学学士 ,技师 ,主要从事分子病毒学研究 1 3 讨论 Brazil97 的相似率达到了 98 % 。根据登革热的潜伏期为 215, 15d ,以及在该病人之后未有相同或近似序列检出 ,同样支持输 2006 年期间 ,广州地区出现了散发性的登革热流行 。在病 人血清中 ,检测出登革 ?型和登革 ?型两种型别的毒株 ,获得 入性登革热的结论 。在得到的登革 ?型株中 ,优势株为 GZ06/ () ) (4 个 代 表 性 序 列 , 分 别 为 GZ06/ 71 、GZ06/ 1707 、GZ06/ 2620 和 1707 8 株和 GZ06/ 2620 13 株。在约 500bp 长的序列中 ,两株 之间仅有 9 个碱基的差别 。根据基因树发现 ,两株病毒与广州 GZ06/ 4525 。 2002 年流行的登革热病毒株的同源性存在较大差别 。参考以 往的报导 ,广州地区登革热流行多呈爆发 、输入性流行的特征 , 1 3 种代表序列相似率比较 表 3 至今仍无证据表明已成为地方性。我们可以初步排除该两 Table 1 Comparison of the similarity rates 株病 毒 是 由 2002 年 的 毒 株 进 化 而 来 。并 结 合 GZ06/ 71 和 毒株 GZ06/ 1707 GZ06/ 2620 GZ06/ 4525 GZ06/ 4525 2 例有确切输入源但未造成流行的病例推测 ,是否 GZ06/ 1707 - 0. 98 0. 92 由于未及时发现和隔离最初从国外归来的已感染登革热的病 GZ06/ 2620 0. 98 - 0. 92 人 ,因而造成登革热的扩散和流行 。有数据显示 ,广州旅行者 GZ206/ 4525 0. 92 0. 92 - 的旅行地以东南亚地区为主 ,由于这些地区气候炎热 ,虫媒活 跃 ,是登革热流行的地区 ,加之旅途疲劳 ,机体抵抗力下降 ,使 4 旅行者感染的机会增大 ,归来后造成登革热传染及流行。 综上所述 ,通过 2006 年登革热流行的情况可以发现 ,由于 广州位于沿海地区 ,登革热的输入对登革热的预防和控制提出 了巨大挑战 。在 2006 年发现的有确切输入源的两例登革热病 人 GZ06/ 4525 和 GZ06/ 71 ,由于发现及时控制得当 ,均未引起登 革热 流 行 。而 引 起 流 行 的 登 革 热 毒 株 GZ06/ 1707 和 GZ06/ 2620 ,都未发现确切的输入源 ,病人均为本地感染 。因此 ,及时 发现和控制传染源 ,加强对外来特别是疫区归来人员的监测 , 对登革热的预防和控制有重要意义 。 图 1 登革病毒基因树图 Fig 1 Phylogenetic tree of Dengue Virus GZ06/ 71 患 者 是 2006 年 广 州 发 现 的 第 一 例 登 革 热 病 人 。 : 参考文献 患者 3 月初从印度尼西亚回国后不适 ,遂入院检查 。从病人血 1 Suwandono A , Kosasih H , Nurhayati , et al1Four dengue virus serotypes 清中分离扩增得到的病毒序列与 2004 年印度尼西亚分离的毒 1 found circulating during an outbreak of dengue fever and dengue haemor2 株最为相近 。据报导,2004 年印度尼西亚登革热流行的优势 毒株为 ?型 。并且 ,在历次印度尼西亚登革热流行中 ,登革 ? rhagic fever in Jakarta , Indonesia , during 2004 J 1Trans R Soc Trop Med 2 型都为优势株。因此 , 无论是流行病 学 还 是 实 验 室 诊 断 结 () Hyg , 2006 ,100 9:855,8621 果 ,都支持这是一例输入性登革热病例 。由于发现及时 ,并对 2 Nono c 1 Sukri , Kanti Laras , Toni Wandra , et al1Transmission of epidemic 该病人采取隔离措施 ,病人居住区灭蚊 ,所以该病毒株未造成 dengue hemorrhagic fever in easternmost Indonesia J 1 Am1 J 1 Trop1 传染及流行 。在随后发生的登革热病人血清中 ,均未检出登革 () Med1 Hyg , 2003 ,68 5:529,5351 ?型病毒核酸 。 3 罗会明 ,何剑峰 ,郑夔 ,等 1 广东省 1990,2000 年登革热流行病学 GZ06/ 4525 病人为一外籍人士 ,并且在发病前几日从国外 () 分析J 1 中华流行病学杂志 ,2002 ,23 6:427,4301 到达广 州 。对 基 因 树 分 析 发 现 , GZ06/ 4525 与 Arg00 , Par00 和 陈国雄 ,何耀明 ,吴烽 1 广州出国旅行者感染登革热风险性的评估 4 ) ( J 1 中国国境卫生检疫杂志 ,2003 ,26 增刊:13,141 收稿日期 :2007 - 07 - 19