L72P突变所致Ⅰ型遗传性高铁血红蛋白血症1例

L72P突变所致Ⅰ型遗传性高铁血红蛋白血症1例 L72P突变所致?型遗传性高铁血红蛋白血症1例 ====================================================================== 【关键词】 细胞色素b5类 细胞色素还原酶 高铁血红蛋白血症 突变 基因 聚合酶链反应 报告遗传性高铁血红蛋白血症(RCM)是由于b5R缺乏引起的一种常染色体隐性遗传性疾病,分为?型和?型。?型又称单纯红细胞型,其酶缺陷仅见于红细 纯合子红细胞中b5R活性显著降低,血中MetHb含量增高,其主要临床症状为胞, 紫绀。笔者应用、DNA序列测定及等分子生物学技术,鉴定1例RCM?型患者b5R基因的突变位点,结合以往工作对此突变进行探讨,分析我国人b5R基因的遗传多态性。 1资料与 1.1病历简介患者,男性,34岁,福建省三明市人。出生后不久即出现口唇、指甲、颧部和耳廓持续性青紫。体检:无心肺疾病,生长发育正常。检查:MetHb含量为40%(正常参考值<1,),其b5R酶活性(Hegesh改良法测定)为0.42 U/g Hb[正常参考值成人(2.2?0.47)U/g Hb],经口服维生素C、维生素B2及静脉滴注美蓝,症状缓解。临床诊断:RCM?型。先证者之弟,MetHb含量0.8 %,其b5R酶活性1.2 U/g Hb。 1.2试剂 还原性辅酶?二钠盐(NADH,上海伯奥生物技术有限公司);噻唑蓝(MTT,美国Fluka公司二氯酚靛酚(DCIP,德国Merck公司);总RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司);反转录试剂盒(美国Promega公司);内切酶EcoR?、BamH?和Eco24?(德国MBI公司);T4 DNA连接酶和Taq酶(上海Sangon公司)。 1.3引物依据b5R cDNA编码序列,其引物设计为: ′ P1的5′端含EcoR?酶切位点,P2的5′端含BamH?酶切位点。扩增片段长度为921 bp。针对72位密码子点突变的检测,设计用于套式PCR扩增的引物序列为: 1.4b5R聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定 1.4.1溶血液制备将正常人、杂合子及患者的抗凝血用生理盐水洗涤2遍,取压积红细胞与等量的溶液混合,4 000 r/min离心5 min,取上清,用调整其血红蛋白浓度为100 g/L。 1.4.2PAGE及b5R活性染色取溶血液8 μL进行PAGE,电压120 V电泳2 h。将凝胶浸在酶底物染色液(含MTT 0.5 g/L、DCIP 0.02 g/L和NADH 0.5 g/L的电泳缓冲液)中,37 ? 15 min,进行酶活性染色。 用试剂盒提取白细胞中总RNA,经反转录后以cDNA为模板,以P1和P2为引物进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25 μL,反应参数为94 ? 45 s?60 ? 45 s?72 ? 60 s,循环30次,72 ?延伸10 min。 1.6b5R cDNA的克隆及序列测定利用T4DNA连接酶将EcoR?和BamH?酶切的PCR产物连接到同样经EcoR?和BamH?酶切的M13载体上。形成的M13重组载体转染至大肠杆菌TG1。提取M13载体,经PCR扩增及酶切鉴定阳性克隆,然后选择阳性克隆的M13重组载体用荧光标记的M13通用引物进行测序。 1.7PCR分析提取白细胞中的基因组DNA,取DNA 200 ng为模板,以W1和W2为引物进行第1轮PCR。PCR反应体系体积为25 μL,反应参数为94 ? 5 min变性,94 ? 60 s?60 ? 60 s?72 ? 60 s，循环30次,72 ?延伸10 min,扩增片断为1.2 kb。然后以上述PCR产物1 μL为模板,以W1和W3为引物进行第2轮PCR,扩增片断934 bp。取第2轮PCR产物10 μL用Eco24 ?酶切消化,酶切产物进行5,聚丙稀酰胺凝胶电泳。 2 结果 2.1b5R PAGE酶活性染色电泳图谱上正常人及杂合子血红蛋白带后均出现一蓝色区带,正常人的蓝色带比杂合子深,而患者未见此条带(图1)。 2.2b5R cDNA序列分析与正常人b5R cDNA序列相比,患者b5R cDNA第72位密码子存在CTC?CCC的点突变(图2)。同时通过对7例正常人和患者的b5R cDNA序列分析,发现我国正常人b5R cDNA第11位和第95位密码子存在同义突变,分别为GTC?GTG和CCA?CCC(结果未显示)。 1:正常人; 2:杂合子; 3:先证者. 2.分析PCR产物经Eco24?酶切后,正常人可产生 490,269,134,32和11 bp 5个片段,而患者产生490,269,166和11 bp 4个片段,二者有明显区别(图3)。 2.4L72P突变相关的?型RCM患者家系分布及特点本室已经鉴定出3个与L72P突变相关的?型RCM家系,均在福建省。其中2个为L72P纯合子,1个为L72P/C203Y复合杂合子(表1)。表1L72P突变相关的?型RCM患者家系分布及特点 3讨论 通过测定MetHb含量和b5R酶活性、b5R cDNA序列以及分析,发现一RCM?型家系,其先证者的b5R基因的第3外显子发生点突变,218位碱基由T突变位C,使该酶第72位的亮氨酸变成脯氨酸。72位的亮氨酸是b5R的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合区β片层结构的组成部分,此氨基酸的改变不仅影响了b5R与FAD的结合,而且改变了b5R分子的二级结构,使酶活性下降。由于成熟红细胞的半衰期长,其自身又不能继续合成蛋白以补充被降解的b5R,所以对红细胞的影响大而对其他组织细胞的影响较小。据文献报道,已发现RCM?型与20种左右b5R基因突变有关。笔者对RCM进行较系统研究,对中国13名RCM?型患者b5R 基因突变位点进行分析,发现6种突变类型,包括L72P、R57Q、C203Y、R60H、M176T和P264L。L72P和R57Q突变是我国较常见的b5R基因突变类型。除本文报道的L72P突变家系外,还在长乐和永泰发现2个L72P突变的家系,前者为L72P纯合子,后者为L72P/C203Y复合杂合子。Arg57Gln突变在国外已有报道,而L72P突变迄今为止只在我国发现且频率高,其有待进一步研究。 本室对5例不同家系的RCM患者和2例正常人的b5R cDNA序列分析发现,b5R cDNA序列与日本学者报道的序列存在差异,表现为第11位和第95位密码子发生同义突变,分别为GTC?GTG和CCA?CCC,提示b5R基因存在遗传多态性。国外文献报道,b5R基因43位密码子存在同义突变(CCG?CCA)和116位密码子发生C?G的颠换,使得116位的苏氨酸变为丝氨酸,后者只出现在具有非洲血统的个体中,发生率较高(超过20,),但不致病。以上报道来自不同国家,提示b5R基因的遗传多态性具有区域性。