探究幽门螺旋杆菌
,
探究幽門螺旋桿菌
,Helicobacter pylori, 尿素酶相關基因及其與疾病的相關性
指導老師,王錦堂 教授 薛如娟 老師
二年溫班 李孟諭 陳昭妤
中華民國89年6月
一、研究動機
近年來有越來越多的證據顯示,幽門螺旋桿菌的感染和慢性胃炎 以及消化性潰瘍的形成有密切的關係。此外,亦有許多的資料顯 示幽門螺旋桿菌的持續性感染是導致形成胃癌和胃黏膜淋巴癌的 主要因素之一,為人類重要病原。
胃方面的疾病一直是國人十大死因中高居不下的一位。在現在吃 得越來越精緻的同時,生病的人數並沒有相對的減少的情況下, 我們希望藉此一窺胃潰瘍及胃癌等疾病的始作俑者??幽門螺旋 桿菌,Helicobacter pylori,
二、研究目的
利用先前已製備突變株的基因庫,篩選出不能利用H. pylori所具 有的控制urea代謝能力的H. pylori變種,找出其基因,根據其基 因型來研發抵抗疾病的
。
三、實驗器材
,一,材料
幽門螺旋桿菌,Helicobacter pylori,的突變株
,二,儀器
37?微嗜氧條件的培養箱,N,80%, CO,15%, O,5%, 222
無菌操作台
微量吸管 ,pipetment,
細菌接種環
培養皿
棉花棒
本生燈
旋轉平台
電子秤
酒精燈
三角玻棒
離心小管,1.5 & 0.5 ml,
乾浴槽
水浴槽
震盪機
比色管
分光比色計
一般離心機
冷凍離心機
真空乾燥機
電泳槽
核酸自動定序儀
水平搖盪器,shaker,
可控溫設定程式之PCR儀器,Programmable Thermal
Controller,
UV攝影機
石蠟紙,parafilm,
,三,藥品
哥倫比亞瓊脂培養基,Agar + Kanamycin 10 ppm + 10%羊血,
尿素斜面瓊脂,urea slant,
回收DNA套組,QIAquick Gel Extraction Kit,
無菌水
cell lysis buffer
protein precipitation solution,NHOA, 4C
異丙醇,Isopropanol,
1%洋菜膠,Agarose,
二次去離子水,dd HO, 2
TAE buffer
ethedium bromide
Hind ?
10X PCR buffer
ligase
10X ligation buffer
Primer 1’
Primer 2’
dNTP
四、研究過程或方法
幽門螺旋桿菌,Helicobacter pylori,為螺旋狀,在其一端具有4~6 根的端鞭毛的革蘭氏陰性菌,形狀如桿狀,一直到1982年才正式 從胃炎和消化性潰瘍病人的胃黏膜上第一次被分離出來,Marshall and Warren, 1984,。
幽門螺旋桿菌的基因組大小約 1700 kb 左右,可
現出的蛋白質 約有六百種。幽門螺旋桿菌通常會在胃黏膜層表面生長,因此幽 門螺旋桿菌必須能存活在酸性的環境中,目前主要是認為幽門螺 旋桿菌在細胞的表面會釋放出尿素酵素,將尿素分解生成氨、二 氧化碳及水,而將幽門螺旋桿菌細胞周圍的酸性環境中和,以利 其生長。
從實驗中我們觀察得知H.pylori 具有可控制代謝urea的基因,當 其遇到尿素時能產生urease,可將urea代謝生成二氧化碳和銨離
urease +子,urea CO+NH,使其得以在胃中如此酸的環境ph=3生存 24
下來。而對人體造成傷害。就目前所知的研究範疇,部份控制urease 的基因已被實驗證明出來,而我們所希望探究的是一些未知的基 因,進而瞭解H.pylori和疾病間的相關性。
測試時我們使用尿素瓊脂斜面,urea slant,,內含酸鹼指示劑,所 以當指示劑因鹼性而變粉紅色時,可由此得知細菌控制urease的 基因未遭破壞,因而可在測試管中代謝urea。挑出未變色或變化較 不明顯的菌號,做進一步的研究。
流程圖,
細菌培養
?
測試urea性狀
?
DNA抽取
?
DNA序列分析
,一,細菌培養,培養由實驗室先前置備的1500種H. pylori突變株,
以挑選在urea test中變色較不明顯的菌株編號,做
進一步的實驗。
1 將冷凍於- 70? 培養的H.pylori突變株stock取20λ滴於盛
有哥倫比亞瓊脂培養基的培養皿上,每一培養皿等分為八份,
均勻塗開,以利細菌生長,放置於37?微嗜氧條件的培養箱中
,N,80%, CO,15%, O,5%,且較濕的環境下培養。 222
2 次培養,subculture,
將八分盤上的H.pylori刮下,塗在新的八分盤上再次觀察。
* 培養基成份,哥倫比亞瓊脂培養基 ,Columbia Agar,
Kanamycin 10 ppm 500λ
Amphtericin B 2 ppm
Vancomycin 3 ppm ,抑制腸內菌的抗生
素共1cc,
10%羊血 25 ml
3 尿素測試,urea test,
將次培養的細菌用棉花棒刮下來放入1000λ的無菌水中,再用
微量吸管在充分吹吸後,吸取700λ用吸光值來判斷其所含菌
之濃度。,定於波長600λ時,吸光值介於0.1~1.0之間為可用
之範圍,我們根據幾次實驗的數據而定下A600λ=0.1為我們
所需的菌濃度。,藉由吸光度計算,調整每一號碼之濃度相
同,吸出相對應的體積滴入urease測試管中,放置20分鐘後,
比較其變色的差異。
,二,DNA抽取,抽取培養中未變色菌號的DNA以做基因的判定。
1 洗菌
將長滿菌落的培養皿放在旋轉平台上加入2?無菌水,用消
毒過,浸泡酒精並過火乾燥,的三角玻棒輕輕刮下,將含有
菌的水吸入離心小管加以離心。
2 打破細胞,cell lysis,
加入600λcell lysis buffer ,pH8.5,與菌輕輕吹吸混合,放置
於乾浴槽中加熱至80?,5分鐘。
3 蛋白質之變性沉澱,protein precipitation,
加入200λprotein precipitation solution,NHOA,,使蛋白質 4C
變性以便離心。離心兩次,各10分鐘。
4 DNA酒精沉澱
取離心後的上清液,加入600λ的異丙醇,Isopropanol,,輕
輕搖晃後可看見雲霧狀的纏繞DNA。
5 DNA分離
將DNA放入- 70? 冷凍庫隔夜,用4? 冷凍離心機離心取
上清液,加入1?70% 的酒精洗去殘留物,做spin down。接
著加以真空乾燥15分鐘,加溫以揮發酒精,加入80?的ddHO 2
以溶解DNA,放置在室溫中隔夜。
6 DNA電泳
將DNA與dye混合,加入1%洋菜膠的小孔,well,裡
〈loading〉,並加入marker做為DNA濃度與大小的基準。電
泳槽中加入TAE buffer,通入150V電流,電泳15分鐘。完
成後將洋菜膠放入ethedium bromide 以shaker均勻染色,並
以UV光及攝影機呈像。
,三,DNA 序列分析
1 DNA酵素完全切碎,complete digestion,
Genomic DNA 15λ
Hind ? 2λ
10X buffer 3λ
DdHO 10λ 2
total V 30λ
# 37?,隔夜
2 DNA黏合,ligation,
complete digestion DNA 5λ
ligase 1λ
10X buffer 2λ
DdHO 12λ 2
total V 20λ
# 16?,18hrs
3反向聚合酶連鎖反應,inverse PCR,
DNA 5λ
primer1’ 2λ
primer2’ 2λ
dNTP 2λ
10X buffer 5λ
Taq 1λ
DdHO 33λ 2
total V 50λ
# 96? 5’
96? 1’
58? 1’ 30 cycles
72? 1’ 30”
72? 10’
4? 24hrs
4 DNA序列分析,sequencing,
mix { Taq polymerace,dNTP+ ddNTP,2.5X buffer} 4λ
templete 5λ
primer 1λ
total V 10λ
實驗操作過程之注意事項
1 所有與細菌有關的實驗都必須盡可能的在無菌操作台上操作以避
免汙染
2 stock從冷凍庫中取出後不能使其回溫過久,以免失去活性
3 若使用冷凍保存之培養基務必不能使培養基上帶有水份,以免影
響實驗的準確性
4 使用恆溫培養箱時一定要將空氣抽取乾淨,減少恆定條件的變化
5 電泳loading後不可大力搖晃電泳槽,避免DNA浮出
6 將洋菜膠染上ethedium bromide時務必要小心,此為致癌物
7 加藥品時先加入體積較大者,若一次需數樣藥品同時加入時,可
先將所有藥品混合再加入
8 在做urea test 時,注意管子需平放,以防範細菌過於集中於某一
點,使濃度分布不均,造成實驗誤差
五、實驗結果
在經過培養600個突變菌株後,我們挑選到了其中6個變色較不
明顯的菌號,推測其控制urea代謝相關的基因遭到破壞,並將其
DNA加以分析定序。
菌號 對應基因 功能
10-20 HP0746 Unknown
10-23 UreB Urease subunit
10-31 HP0373 Putative outer
membrane protein
10-35 HP0771 Unknown
10-59 HP1207~HP1208 Unknown
10-72 UreB Urease subunit
,一, DNA電泳結果 《附圖1.2.3.》
,二, sequencing結果 《附圖4》
六、討論
,一,一開始實驗時,我們並沒有考慮到菌量濃度的影響,所以實驗
的結果並不理想,可信度也不高,在經過研究討論之後,我們
採取了較為繁複的定量方式,重新開始實驗,希望能夠降低誤
差。
,二, 實驗室先前所製備的基因庫,約有1500個突變株,我們僅就其
中的600個來進行實驗,而事實上需要篩選過一整個完整的基
因庫才具有代表性,因此雖然目前我們已經看到部分和代謝urea
相關的基因,但仍要在篩選過所有突變株之後,才有可能有一
個較為完整的結果。
,三, 根據我們目前所做出的DNA序列分析,可以初步知道這些和代謝urea相關的基因的位置,但仍無法確定代謝urea的功能是否為其他上游基因所間接控制,或由這些我們所判讀出的基因本身直接控制,也無法得知是否有其餘數個基因與其共同控制性
狀的表現。
七、結論
,一, 因為之前的實驗經驗,使我們這次採用了較為麻煩的方法?利
用吸光度,使待測菌之濃度均相等、測試時間也都一樣,若是
沒有採取濃度的定量,則urea管的變色將會受到菌量多寡而有
程度上的差異,使得即使被篩選出來的突變株,可信度也不高。
所以,濃度定量,大大減少了可能影響實驗一個嚴重的誤差性,
也相對的提高了我們實驗的準確性。
,二, 在這次篩選過程所挑出來的六個突變株,比對網路上的基因庫
後,有兩個(10-20 &10-72)的基因型和先前已被研究證實的ureB
此基因型幾乎完全相同,這就更加確定了我們實驗方向及方法
的正確性。更幸運的是我們還比對到了三個尚未有明確功能
(Unknown)的菌號,因此,未來可以朝這三個基因和urease的
相關性研究。
幽門螺旋桿菌為對人類體來說為一重要之病原,未知的部份還很多、其發展性亦甚大,我們只就其中的一小部分進行研究,而我們的實驗設計中還有很多缺失與不完滿,我們將繼續努力,綜合上述之方
法並再加以研究改良來尋求能有更多更好的研究結果。
八、參考資料
曹銘陽 以表現基因庫及基因比對選殖幽門螺絲桿菌之多重藥物
排出幫浦相關基因
林肇堂 胃腸疾病與幽門螺旋桿菌,健康世界雜誌社。1995
誌謝
張凱誌先生
林稚容小姐