[DOC] 载长春新碱微泡的体外释药性质研究

[DOC] 载长春新碱微泡的体外释药性质研究 载长春新碱微泡的体外释药性质研究 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VO L.22NO.6时珍国医国药2011年第22卷第6期 载长春新碱微泡的体外释药性质研究 凌旭,张良珂,袁佩,李攀.,冉海涛 (1.重庆医科大学生命科学研究院,重庆400016; 2.重庆医科大学药学院,重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆400016; 3.重庆医科大学附属第二医院超声影像学研究所,重庆400010) 摘要:目的考察载长春新碱的聚乳酸一乙醇酸一聚乙二醇共聚物(PLGA—PEG)微泡的体外释药性质.方法采用W/ O/W复乳一溶剂挥干法制备微泡,测定微泡的包封率,粒径和Zeta电位,考察不同分子量PLGA,PLGA—PEG加入比例, 以及施加超声对微泡的体外释药的影响.结果所制备微泡平均粒径约为1.27txm,包封率为(37.63?0.61)%,Zeta电 位为一24.88mV,低分子量PLGA微泡释药速率较快,添加 PEG的微泡释药速率增加,体外施加超声可加速药物 PLGA— 释放.结论考察了不同条件对微泡体外释放的影响,为载药微泡的应用奠定了基础. 关键词:长春新碱;微泡;体外释放 DOI标识:doi:10.3969/i.issn.1008-0805.2011.06.023 中图分类号:R284.2文献标识码:A文章编 号:1008—0805(2011)06—1339-02 InVitroReleaseCharacteristicsofVincristineSulfateMicrobubbles tao LINGXu’.ZHANGLiang.ke’,YUANPei,LIPan,RANHai— (1.InstituteofLifeSciences,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.SchoolofPharmacol— ogy,ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistry&MolecularPharmacology,ChongqingMedicalUniversity, Chongqing400016,China;3.InstituteofUltrasoundImaging,SecondAffiliatedHospital,ChongqingMedical University,Chongqing400010,China) Abstract:ObjectiveTostudyinvitroreleasecharacteristicsofvincristinesulfatemicrobubbles.MethodsAwater—in—oil—in — waterdouble—emulsion/solventevaporationmethodwasusedtopreparemicrobubbles.Ultravioletspectrophotometrywasap— pliedtodeterminetheentrapmentefficiencyofmicrobubbles,andparticlesize,zetapotentialweremeasuredbymalverulaserparti— clesizemeasuringinstrument.TheeffectofdifferentmolecularweightofPLGA,differentratioofPLGA:PEGandultrasoundon theinvitroreleasecharacteristicsofmicrobubbleswerestudied.ResetsThem eandiameterofacquiredmicrobubbleswas1.27 txm.Thedrugentrapmentefficiencywas(37.63?0.61)%andzetapotentialw as一24.88mV.Withtheuseoflowweight PEGandtheuseofutrosonic,thedrugrelea PLGA,increasedratioofPLGA— seofmicrobubblesincreased.ConclusionThe effectofdifferentconditionsonthereleaseofmicrobubblesinvitrowasstudie dandthefoundationfortheapplicationofdrug— loadedmicrobubbleswaslaid. Keywords:Vincristine;Microbubble;Invitrorelease 长春新碱(Vincristine,VCR)是提取白夹竹桃科植物长春花 的一种生物碱,临床用于治疗神经细胞瘤等.由于具有明显的剂 量限制性神经毒性,全身给药常引起毒副反应,大大限制其临床 应用….微泡通常是指直径为100m以下的有壳微气泡,微泡 壳厚1—500nm,壳体材料多为白蛋白,聚合物等,泡内气体通常 是CO,,氟碳气等. 本文以乳酸一乙醇酸共聚物[Poly(1actide—co—glycolide), PLGA]和聚乳酸一乙醇酸一聚乙二醇共聚物(PLGA—PEG)为膜 材,采用复乳一溶剂挥干法制备载VCR聚乳酸一乙醇酸一聚乙 二醇共聚物微泡(Vincristine—loadedPLGA—PEGMicrobubbles, VCR—PLGA—PEG—MB),并考察了不同PLGA分子量,PLGA— PEG加入比例,外加超声等因素对其体外释药的影响,为载药聚 收稿日期:2010-08—22;修订日期:2010—12-08 基金项目:重庆市科委自然科学基金(No.CSTC,2008BB5397); 重庆医科大学校办课项目(No.NSFYY200728,XBYB2007098) 作者简介:凌旭(1983一),男(汉族),湖南株州人,现为重庆医科大学药学 院在读硕士研究生,学士学位,主要从事中西药物新型给药系统研究工作. 通讯作者简介:张良珂(1974一),男(汉族),河北保定人,现任重庆医科大学副 教授,硕士研究生导师,博士学位,主要从事中西药物新型给药系统研究工作. 合物微泡的应用奠定基础. 1材料与仪器 1.1试剂与动物PLGA[LA/GA=50:50,Mw=20kDa(或40 kDa,山东医疗器械研究所],PLGA—PEG(PEG:Mw=2000,PL— GA:Mw=20kDa,山东岱罡化学试剂厂),VCR(批号021001, 纯度98.9%,广州环叶制药有限公司),聚乙烯醇(PolyvinylAlco— hol,PVA,日本可乐丽公司),Span80(上海申宇医药化工有限公 司),D一葡萄糖(AR,上海楷洋生物技术有限公司),氟碳气(重 庆医科大学附二院超研所提供),速眠新11(吉兽药[2004] 005013,军事医学科学院军事兽医研究所),其余试剂均为 纯.新西兰大白兔(雄性,体质量为2.0—3.0kg,重庆医科大学 实验动物中心). 1.2仪器SartoriusA200s分析天平,SonicsVCX750超声波细胞 破碎仪,OlympusTH一200光学显微镜,旋转蒸发器(RE一52 AA,上海亚荣生化仪器厂),MalvernZetasizerNanoZS90激光粒 径分析仪,ChristAlpha1—2LD冷冻干燥机,UGT1025超声转染 仪(重庆医科大学附二院超研所自制). 2方法与结果 2.1VCR—PLGA—PEG—MB的制备及相关性质 2.1.1VCR—PLGA—PEG—MB的制备采用复乳一溶剂挥干 ? 1339? 时珍国医国药2011年第22卷第6期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VO L.22NO.6 法制备微泡.精密称取2.0mgVCR,PBS溶解作内水相(W1), 适量PLGA或PLGA—PEG,Span80溶于2.0ml二氯甲烷作油相 (0),混合W1和0,冰浴探头超声10S,得初乳(W/O);配制1% PVA水溶液作外水相(W2),将W2加入初乳中,超声10s形成 复乳(W/O/W).旋转蒸发挥干二氯甲烷,离心10rain(3000r/ rain),沉积物用蒸馏水洗涤两次.冷冻干燥,真空下充入氟碳气 体,得VCR—PLGA—PEG—MB. 2.1.2VCR—PLGA—PEG—MB的粒径分析采用Malvem激光 粒径测量仪测定其粒径分布及Zeta电位,VCR—PLGA—PEG— MB平均粒径为1.27m,Zeta电位为一24.88mV. 2.1.3VCR—PLGA—PEG—MB包封率的测定采用紫外分光 光度法测定包封率.经紫外扫描,确定VCR的最大吸收波长为 296nm,相关辅料在此波长处不干扰测定.以二氯甲烷和甲醇混 合溶剂(3:1,WV)溶解微泡,测定微泡中包裹的VCR含量.按 下述计算包封率.包封率(%)=微泡载带的VCR重量/ 投药量×100%.制备三批VCR—PLGA—PEG—MB,测定其包 封率为(37.63?0.61)%. 2.2体外释放实验 2.2.1体外释放实验精密称取适量VCR—PLCA—PEG—MB, 装入透析袋中,置于装有2O.0mlPBS的具塞瓶中.恒温(37? 0.5)?水浴振荡(70?5)r/rain,在预定的时间里取样5.0ml,微 孔滤膜过滤,测定吸光度A值,代入曲线方程计算累积释放 率,同时补充等量PBS. 2.2.2标准曲线绘制精密称取VCR10.0mg,PBS配制成40.0 g?m1的VCR母液.分别配制成2.0,4.0,8.0,10.0,20.0g ?ml系列工作溶液,在296nm测定吸光度A,以吸光度(A)对 浓度(C)进行线性回归,得回归方程:A=0.0157C一0.0007,r= 0.9997.VCR在2.00—20.00g?ml浓度范围内,吸光度与 药物浓度呈良好的线性关系,辅料不干扰VCR的测定. 2.2.3不同分子量聚合物体外释药行为比较采用2万和4万 分子量PLGA各制备3批样品,进行体外释放实验.由图1可 知,VCR在2h内基本释放完全,以20kDaPLGA为膜材制备微 泡的累积百分释放在20d基本释放完全,而以40kDaPLGA为 膜材制备微泡的累积百分释放在30d基本释放完全,原因可能 是20kDaPLGA分子量较小,其在体外溶蚀速度较快,从而释药 的速率较快. 图1不同分子量PLGA对微泡药物释放影响 2.2.4PICA—PEG加入比例对VCR—PLGA—PEG—MB体外 释药行为影响分别制备PLGA:PLGA—PEG为1:2,2:1,1: 1的VCR—PLGA—PEG—MB进行体外释药研究.由图2可知, 不同PLGA:PEG比例对药物累积释放有一定影响,其中PLGA: PEG为1:2时释放速度最快,释放16天后能达到90%左右,而 PLGA:PEG为2:1时释放速度最慢,释放16d后能达到80% 左右.PLGA—PEG在微泡中的含量增加会增加微泡的亲水性, 从而增加药物的释放速度. 2.2.5体外施加超声对VCR—PLGA—PEG—MB释药行为影响 精密称取适量VCR—PLGA—PEG—MB,分散于透析袋中,将超 声基因转染治疗仪探头紧贴透析袋(设置功率为2.0w/cm,频 ? 1340? 率300kHz).开启仪器,在预定的时间里取样5.0ml,补充37% 相同体积的释放介质,微孔滤膜过滤,测定吸光度4值,代入标准 曲线方程计算累积释放率,同时补充等量PBS.. 由图3可知,施加超声的VCR—PLGA—PEG—MB在60rain 累积药物释放能达到80%以上,而未加超声组累积药物释放在 30%左右,VCR—PLGA—PEG—MB在超声作用下释药速率明显 加快. 一图2不同PLGA:PEG比例对微泡药物释放影响 一Noaddlngultrasound — -卜Addlngutras0und ,d 图3超声下VCR—PLGA—PEG—MB的药物释放 3讨论 超声造影是近年随着超声造影剂制备技术和图像显影技术 的不断完善逐步发展起来的新技术.超声微泡造影剂多为内含 气体的微气泡,填充气体可为CO,空气或大分子惰性气体(如氟 碳气体)等;其成膜材料有磷脂类化合物,白蛋白,糖类,非离子 面活性剂,可生物降解的高分子聚合物等.氟碳气体分子量较 大,溶解度和弥散度较低,是较优良的填充气体.天然或合成的 高分子聚合物制备的超声微泡抗压性和稳定性高,其中使用较广 泛,研究较多的是高分子聚合物PLGA,PLGA生物相容性好,降 解产物无毒,分子结构中无肽链,无免疫原性.. 近年来的研究表明超声微泡在携带药物与基因进行靶向给 药方面具有重要的临床应用价值.其作用机制是超声微泡内含 的微小气泡(空化核)在超声波作用下产生振荡,扩大,收缩至内 爆等一系列动力学效应,即空化效应,增加超声照射下的空化效 应,对细胞产生短暂可逆的”声孔作用”,使细胞膜通透性短暂的 增加,从而药物或治疗基因能够进入到细胞内J. 本文实验结果表明添加了PLGA—PEG的微泡释放速度增 加,可能是微泡表面被柔顺而亲水的PEG链部分覆盖,极性基 PEG增强了VCR—PLGA—PEG—MB的亲水性,在释放过程中聚 合物更易溶蚀,从而加快释放.添加了PLGA—PEG的微泡有明 显的突释现象,且随PLGA—PEG的添加量增加,突释量增加, 可能是部分药物包裹于VCR—PLGA—PEG—MB的PEG亲水层 或VCR—PLGA—PEG—MB的外部近表面部分.突释之后的缓 慢释放主要是由于膜材的缓慢降解速率造成的.VCR—PLGA— PEG—MB的药物突释可弥补PLGA膜微泡释药速率过于缓慢的 不足,在较短时间内达到有效药物浓度. 对微泡施加超声影响后,药物释放速度加快,可能是在超声 波作用下,释放介质很快地渗透到微泡中,药物释放加快,另一方 面可能是由于超声空化和声孔作用使部分微泡破裂,基质的溶蚀 加快,包裹的药物较快释放. 本文采用聚乳酸一乙醇酸一聚乙二醇共聚物(PLGA—PEG) 舌:??蚰如0 一口暑?u LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011V OL.22NO.6时珍国医国药2011年第22卷第6期 制备的微泡,其表面被柔顺而亲水的PEG链部分覆盖,极性PEG 增强微泡的亲水性,减少血浆蛋白与微泡膜的相互作用,降低被 巨噬细胞吞噬的可能,延长在循环系统的滞留时间. 参考文献: GiddingC,KellieS,KampsW,eta1.Vineristinerevisited[J].Crit RevOnco1Hematol,1999,29(3):267. 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WANGYu.mei’.WANGFei.XIAOHuai (1.CollegeofPharmacology,DaliUnive~ity,Dali671000,China;2.KunmingXiliBio—techCo.,Ltd,Kun— ming650204.Cina) Abstract:TwelveknowncompoundswereobtainedfromtheEtOHextractofthetwigsandleavesofCallicarpaarboreaRoxb.. Basedonextensivespectroscopicanalysis,theirstructureswereidentifiedas:antiarolrutinoside(1),kelampayosidesA(2),mar- tynoside(3),isomartynoside(4),lirioresinolB(5),syringicacid(6),antiaiol(7),betulin(8),ursolicacid(9),lutein(10), sitosterol(11)anddaucosterol(12).Allcompoundswereobtainedfromthisplantforthefirsttime. Keywords:CallicarpaL.;CallicarpaarboreaRoxb.;Phenolicglycosides;Phenylpropanoidglycosides;Lignans 木紫珠CallicarpaarboreaRoxb.为马鞭草科紫珠属植物,主 要分布在我国广西,云南南部和西藏东南部,尼泊尔,印度,孟加 拉,缅甸等国也有分布.该植物根,叶具有清热解毒,散淤止血, 消肿止痛等功效,用于治疗衄血,咯血,胃肠道出血,妇女崩漏,外 伤出血,咽喉肿痛,跌打肿痛,风湿骨痛,烧伤等.经相关数据 库检索发现,国内外对木紫珠化学成分研究的报道较少.为了更 收稿日期:2010-08-05;修订日期:2010-11-01 基金项目:云南省自然科学基金(No.2009ZC122M) 作者简介:王玉梅(1985-),女(汉族),湖南涟源人,现为大理学院药学院 在读硕士研究生,主要从事天然药物成分研究工作. 通讯作者简介:肖怀(1973?),女(汉族),云南风庆人,现任大理学院 药学院副教授,硕士研究生导师,硕士学位,主要从事天然药物化学研究 工作. 深入地了解木紫珠中的化学成分,我们对其地上部分进行了化学 成分研究,运用各种化学分离手段从木紫珠95%醇提物中共分 得12个化合物,分别为:antiarolrutinoside(1),kelampayosidesA (2),地黄苷(3),异地黄苷(4),lirioresinolB(5),丁香酸(6),an- tiaiol(7),桦木醇(8),乌苏酸(9),叶黄素(1O),谷甾醇(11),胡 萝卜苷(12).以上化合物均为首次从该植物中分离得到. 1仪器和材料 UV210A型紫外可见光分度计;BrukerAV一400和DRX一500 核磁共振光谱仪.柱色谱硅胶(200,300目)和薄层色谱硅胶 GF254(青岛美高集团有限公司);反相填充材料Rp一18(40—75 Ixm,日本Fuji公司);凝胶为SephadexLH一20(AmershamBiosci. ences,Sweden);显色剂为10%的H2SO4/EtOH溶液.木紫珠采集 于云南河口,由中国科学院昆明植物研究所陈愈老师鉴定. 2方法与结果 2.1提取与分离干燥木紫珠根茎部分6.5,粉碎后用工业乙 ? 134l? 1j1J1J l2345 r;rLrL