4种DNA提取方法在陈旧骨骼DNA检测中的性能评价.doc

4种DNA提取在陈旧骨骼DNA检测中的性能评价.doc 4种DNA提取方法在陈旧骨骼DNA检测中的性能评价 摘要:目的:对陈旧骨骼DNA检测中运用4种DNA提取方法的性能 进行评价，寻找出从陈旧骨骼中提取DNA的有效提取方法。方法:运用传 统的有机结合Microcon100纯化柱法，硅珠法，磷酸盐缓冲方法以及 promega公司骨骼孵育液方法对陈旧骨骼DNA进行检测。结果:对采用四 种DNA提取方法可取到得陈旧骨骼DNA运用常规的荧光标记复合STR基因 分型法进行成功分析。结论:四种DNA提取方法在陈旧骨骼DNA检测中， 提取陈旧骨骼DNA都取得了良好的效果。 关键词:Microcon100纯化柱法;硅珠法;磷酸盐缓冲法;promega 骨骼孵育液法;陈旧骨骼DNA;性能评价 Four kinds of DNA extraction methods in old bone DNA testing in performance evaluation Wang He Wang Yi’nan Chu Zheng Shi Jinwei Abstract:Objective: to test old bone DNA using 4 kinds of DNA extraction methods， and find out the most effective one by performance evaluation. Methods: using the organic combination of traditional Microcon100 purification column method， silicon bead method， phosphate buffer method and promega company bone incubation solution method for old bone DNA testing. Results: to use four kinds of DNA extraction method preferable to have old bone DNA using conventional fluorescent marker composite STR genetic parting method for the successful analysis. Conclusion: four kinds of DNA extraction methods in old bone DNA detection， extraction old bone DNA has achieved good effect. Key words: Microcon100 purification column method; Silicon bead method; Phosphate buffer method; promegaBone incubation liquid method; Old bone DNA; Performance evaluation 【中图分类号】R379 【文献标识码】A 【文章编号】1674-7526(2012) 12-0500-02 在法医实践研究中，对于有关DNA的检验已经成为对个体进行识别鉴 定的常规技术之一。骨骼是一种比较特殊的生物检测材料，因为外部有坚 硬的保护组织，所以相对于人体的其他组织脏器器官的降解比较慢。但对 于高度腐化及白骨化的样本来说，骨骼是进行DNA检测的有效检测材料之 一，由于骨骼组织特殊的结构和环境对其的影响，促使提取骨骼DNA显得 更加困难。本文运用四种方法提取骨骼DNA并取得了良好的检测性能，现 将方法结果如下: 1 一般资料 1.1 资料与方法 (1)材料:骨骼样本96根，均来自于本院日常送检的案件。骨骼时 限0.5年至30年，送检骨骼包括股骨、肱骨以及肋骨等，现场的环境有 泥土的掩埋，水中的浸泡以及焚烧等。 1.2 方法 (1)样本处理:将样本96根骨骼，随机分成4份，每份24份。使用手术刀将每份样品面的污垢杂质清理干净，再用蒸馏水冲洗后晾干，经液氮研磨成小块后，电锯锯取所需的骨粉。 (2)骨骼DNA提取4种方法 传统的有机结合Microcon100纯化柱法:取所需骨粉装于试管中并加入适量的EDTA溶液浓度，均匀搅拌，每12小时进行一次脱钙，共计3次，未去除上清每次采用无菌水进行清洗，在沉淀渣中加入适量的裂解溶液，抽取Microcon100纯化柱纯化浓缩液对DNA进行回收。 硅珠法:将骨粉用去离子水、乙醇浸泡并晾干。取骨粉5g，加入适量的EDTA(0.5mmon/L)溶液，搅拌均匀放于摇床上进行脱钙12小时，再用去离子水清洗2遍，去除上清，反复4次[1]，在沉渣中放入适量裂解液在56?下放置12小时后加入DTT加至100ng/ml的浓度，12000r/min离心，取上清液根据硅珠法对DNA提取[2]。 磷酸盐缓冲方法:先对骨粉进行脱钙，然后进行离心，在去除EDTA后加入新鲜配制的磷酸盐消化缓冲液0.5ml左右，在56?下消化至完全，此后加入近3倍的吸附液，在56?下保温1个小时后提取DNA。 promega公司骨骼孵育液方法:在骨粉中加入液氮研钵按照其公司提供的方法进行(http;//www.promega.com.cn/ctbs/index.htm)。 (3)电泳检测 对4组中扩增后的样品进行遗传分析仪的检测，电泳的条件按照说明书进行。 2 结果 (1)在使用传统的有机结合Microcon100纯化柱法和磷酸盐缓冲方 法对陈旧骨骼DNA进行提取，经过Identifiler试剂盒的扩增，所有的基因座都能够得到扩增。 (2)在使用硅珠法对陈旧骨骼DNA进行提取，经过Profiler Plus试剂盒的扩增，所有的基因座都得到扩增。 (3)在使用promega公司骨骼孵育液方法提取陈旧骨骼DNA，经过公司试剂盒的扩增，所有基因座均扩增。 表1 4种DNA提取方法在陈旧骨骼DNA检测率比较(浓度均值为0.43ng/ml) 注:4种方法的检测率比较差异无统计学意义(P>0.05)。 3 讨论 骨骼DNA主要来自于三种细胞，包括骨细胞、破骨细胞以及成骨细胞。由于外层有坚硬的骨密质保护，骨骼较人体的其他组织器官的腐败程度要慢，并在外界环境的影响下，骨骼酶的消化更加缓慢，因此骨骼在更好地保存DNA的同时，也加大了其中DNA提取难度。 传统的有机结合Microcon100纯化柱法步骤操作简单，并且为常规的试剂，使用成本低廉，比较适用于基层法医的使用。PCR抑制物在陈旧骨骼DNA中较多，而且也不可能完全除尽，PCR结果与提取到的DNA量的多少并无关联[3]，所以对于陈旧骨骼DNA来说，DNA量的多少不太重要，质才是重点，传统的有机结合Microcon100纯化柱法虽然对DNA有些损失，但是提取的量较高。 硅珠法提取DNA，尽管减少了因转移造成的损伤，但是底物和其他的试剂得到保留，DNA的纯度比有机溶剂提取法低，并且浓度不容易控制[4]。 磷酸盐缓冲方法和QIAamp试剂盒法在进行常规的扩增检验后，均获 得了较高的成功率，操作步骤简单，在实际的检测中具有比较高的实用价 值。但是这两种方法需要比较长的脱钙时间，检验周期也比较长，此外， 由于陈旧骨骼中的DNA少，所以取材量大，因此在取用材料时，DNA的提 取和PCR的扩增工程中都需要严格的避免污染[5]。 此外，在提取DNA时还需注意的是对选取的骨骼要清洗干净，避免外 源对此的污染，骨粉要进行充分的细化，越细的骨粉对于骨细胞的暴露就 越明显，了解掌握陈旧骨骼腐败的程度，对此可适当增加脱钙的次数，近 而保证脱钙的彻底。 参考文献 [1] 张杰，薛庆杰，唐光峰，等，陈旧性骨骼DNA提取[J].法医学杂 志，2006，(1):24-25 [2] 王林生，苏勇，顾林刚.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中国法医学 杂志，2000，15(1);36 [3] von Wurmb-Schwark N， Schwark T， Harbeck M，et al. A simple Duplex-PCR to evaluate the DNA quality of anthropological and forensic samples prior short tandem repeat typing[J].Legal Medicine.2004.6;80-88 [4] 郑秀芬.法医DNA分析[M].北京;中国人民公安大学出版社，2002; 37-45 [5] Baker L E，McCormick W F，Matteson K J，et al. A SilicaBased Mitochondrial DNA Extraction Method Applied to Forensic Hair Shafts and Teeth[J].J Forensic SCI，2001 46(1):126