泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响

泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响 泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾 组织骨桥蛋白表达的影响 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月?1827? 制提供理论和实验基础;为进一步开展方剂研究提供 策略;为临床治疗多发性骨髓瘤及其他恶性肿瘤开辟 新的道路,具有重要的理论意义和应用前景. References: [1]Jinz.AmaryllidaceaeandSceletiumalkaloidsEJ1.NatProd Rep,2005,22(1):111—126. [21LiuJ,HuWX,HeLF,eta1.EffectsoflycorineonHL一60 [3] [-41 [5] [6] cellsviaarrestingcellcycleandinducingapoptosis[J]. FEBSLett,2004,578(3):245—250. ChuKT,NgTB.Firstreportofaglutamine—richantifun— galpeptidewithimmunomodulatoryandantipr0Iiferativeac— tivitiesfromfamilyAmaryllidaceae[J1.BiochemBiophysRes Commun,2004,325(1):167—173. ThenM,SzentmihalyiK,SarkoziA,ela1.Effectofsample handlingonalkaloidandmineralcontentofaqueousextracts ofgreatercelandine(ChelidoniummajusL.)[J1.JChro— matogrA,2000,889(1-2):69—74. MosmannT.Rapidcolormetricassayforcellulargrowthand survival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays [J1.JImmunolMethods,1983,65(1-2):55—63. 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Crocker.Nucleolarorganiserregions[J1.CurrTop Patho1.】99O,82:9】一】49. 泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响 米其武,曹正国.,刘继红,吴继洲.,尹春萍.,周四维,叶章群 (1.华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科,湖北武汉430030;2.安徽省立医院泌尿外科, 安徽合肥230001;3.华中科技大学同济医学院药学院,湖北武汉430030) 摘要:目的研究泽泻有效部位对大鼠肾草酸钙结石形成和肾组织骨桥蛋白(OPN)表达的影响,探讨泽泻抑制 尿结石形成的机制.方法采用现代植化和生物活性导向分离的方法分离,提取泽泻的有效部位.将3O只大鼠随 机分成3组:对照组,模型组,泽泻组.以乙二醇和1a一羟基维生素D.ig制备大鼠肾草酸钙结石模型.检测各组大鼠 血及尿生化,肾Ca抖水平,24h尿草酸分泌量和肾组织病理学改变,并采用免疫印迹(Westernblotting)和半定量 逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)分别观察各组大鼠肾组织OPN蛋白及其mRNA 结果ig泽泻有 的表达水平. 效部位(主要以四环三萜类化合物为主)大鼠的血清肌酐(SCr),尿素氮(BUN),肾Ca水平,24h尿Ca分泌 量,肾组织草酸钙晶体的分布,OPN蛋白及其tuRNA的表达水平均显着低于模型组(P<0.01).结论泽泻有效 部位能抑制大鼠肾组织OPN的表达,减少肾组织草酸钙结晶的沉积,从而能有效抑制大鼠肾草酸钙结石的形成. 关键词:泽泻;尿石;骨桥蛋白;草酸钙 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:0253—2670(2005)12—1827—05 EffectsofactivefractionofAlismaorientaleonosteopontinexpressioninrenaltissue ofurOljthiasismodelratwithcalciumoxalatestone MIQi—wu,CAOZheng—guo,LIUJi—hong,WUJi—zhou.,YINChun—ping., ZHOUSi—wei,YEZhang—qun (1.DepartmentofUrology,AffiliatedTongjiHospitalofTongjiMedicalCollege,Huazhong UniversityofScience andTechnology,Wuhan430030,China;2.DepartmentofUrology,AnhuiProvincialHospital, Hefei230001,China;3.SchoolofPharmacy,TongjiMedicalCollege,Huazhong UniversityofScienceandTechnology.Wuhan430030,China) 收稿日期:2005一O4一O2 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970891) 作者简介:米其武(1963一),男,辽宁朝阳人,副主任医师,在读博士研究生,主要从事 泌尿外科尿石症和膀胱肿瘤的研究. Tel:(0769)2223412-3701E—mail:mqwl75@163,corn ?1828?中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月 Abstract:ObjectiveTostudytheeffectsofactivefractionsofAlismaorientaleonurinarycalcium oxalatestoneformationandosteopontin(OPN)expressioninurolithiasismodelratsandtOexplorethe mechanismofA.orientaleonthepreventionoftheformationfromurinarycalculi.MethodsTheactive fractionsofA.orientalewereseperatedandextractedwithisolationtechniquesguidedbymodernphyto— chemistryandbioactivity.AdultmaleWistarrats(30)wererandomizedintothreegroups,theywerecon— trol,model,andA.orientalegroups.Themodelratswithrenalcalciumoxalatestoneformationwerein— ducedbyigethyleneglycolandla— hydroxyvitaminD3forfourweeks.Thecalciumoxalatedepositinthe kidneywasobservedbymicroscopy.TheSCrandBUNlevels,renaltissuecalciumcontent,24hurinary oxalicacidexcretion,andphysiologicalchangeinrenaltissuewerealsodetected.Westernblottingand RT—polymerasechainreaction(RT— PCR)techniqueswereusedtOobservetheproteinandmRNAexpres— sionofOPNinratrenaltissueofeverygroups.ResultsSCrandBUNlevel,renaltissuecalciumcontent, 24hurinarycalciumexcretion,crystaldeposition,andtheOPNexpressionintheratsbyigactivefrac— tionswhichwereidentifiedastetracyclictriterpenoids,weresignificantlylowerthanthoseinmodelgroup (JP<O.01).ConclusionTheactivefractionsofA.orientalecaninhibittheOPNexpressionanddepositof calciumoxalateinrenaltissueSOastoblocktheformationofrenalcalciumoxalatestoneinratspotently. Keywords:Alismaorientale(Sam.)Juzep.;urinarycalculi;osteopontin(OPN);calciumoxalate 泽泻Alismaorientale(Sam.)Juzep.是治疗 泌尿系结石的常用传统中药,以往的研究已证实泽 泻的有效部位醋酸乙酯浸膏能显着抑制大鼠肾草酸 钙结石的形成[1],但目前国内外尚未见泽泻抑制'肾 草酸钙结石形成的活性部位及其作用机制的研究报 道.骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种富含天冬 氨酸的磷酸化糖蛋白,体外实验表明能显着抑制草 酸钙晶体的成核,聚集和与'肾小管上皮细胞的黏附, 认为可能是草酸钙结石的抑制因子L2].本课组在 前期工作的基础上采用现代植化和生物活性导向分 离的方法进一步从泽泻中分离得到了一种化合物, 体外研究已证明其对草酸钙结晶有抑制作用L3].本 实验分别用免疫印迹(Westernblotting)和半定量 逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)初步观察了泽泻 的活性部位对'肾草酸钙结石模型大鼠'肾结石形成和 '肾OPN及其mRNA表达的影响,为泽泻在抑制'肾 草酸钙结石形成的作用机制方面的深入探讨提供了 实验依据. 1 泽泻有效部位的提取:泽泻粗粉(产于福建,由 华中科技大学同济医学院药学院吴继洲教授鉴定) 10.5kg,用50甲醇回流提取,回收甲醇得浸膏约 2kg,加适量水溶解后,用醋酸乙酯萃取并回收醋酸 乙酯得到醋酸乙酯浸膏212g,留45g配样,其余的 用硅藻土柱色谱分离,以醋酸乙酯洗脱,回收溶剂得 到醋酸乙酯洗脱液,经硅胶柱色谱分离,用石油醚洗 脱并反复柱色谱分离后得到提取物2.1g.将该提取 物与25.0mL无水乙醇和25.0mL聚山梨酯一8O 充分混匀后,用蒸馏水定容至500mL备用(其主要 成分为四环三萜类,相当于含生药20.0g/mL). 2方法 2.1动物模型制备和分组处理:Wistar健康雄性 大鼠30只,体重180,220g,随机分为3组,每组 1O只.A组(对照组);B组(肾草酸钙结石模型 组):参照文献报道方法_4复制大鼠'肾结石模型.以 1乙二醇+1a一羟基维生素D.为诱石剂,隔天 给予,每只0.5g.g;C组(泽泻组):在给予与B组相 同诱石剂的同时,每天ig泽泻提取物5.omL/kg (相当于生药100.0g/kg,预实验证明此剂量为最 佳剂量).各组大鼠均给药4周. 2.2一般观察指标及检测方法:实验结束前1d称 体重,比较实验前后大鼠体重的变化,用代谢笼收集 并测定24h尿量,尿液pH值,24h尿草酸的分泌 量(过氧化氢一盐酸苯肼法).戊巴比妥ip麻醉后, 严格无菌操作下行下腔静脉穿刺取血,离心取上层 血清,用OlympusAul000自动仪测血清尿素 氮(BUN),血清肌酐(SCr)水平;同时切取'肾组 织,一部分置液氮罐保存备用,另一部分以10中 性福尔马林固定,作常规HE石蜡切片和 PizzllatoS染色,光镜下观察'肾组织草酸钙结晶形 态分布及肾组织的病理改变.Hitachi180—80型原 子吸收光谱仪进行'肾组织Ca抖,尿总Ca.测定. 2.3Westernblotting检测肾组织OPN蛋白的表 达:匀浆器处理'肾组织,用预冷的PBS洗2遍,加入 5倍体积的组织蛋白裂解液,置冰上30min,离心 (12000×g)2min,取上清液,测蛋白浓度.取10 L加入等体积2x上样缓冲液,煮沸10min,离心 后取上清液.制备10非连续SDS—PAGE凝胶, ?1829? 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月 每孔加变性后的总蛋白100tsg,在100V下电泳, 至溴酚蓝达到凝胶底部,恒流320mA,2h后将蛋 白电转移到PVDF膜.5%脱脂奶粉封闭2h,加入 1:1000稀释兔抗人0PN多克隆抗体(美国 SantaCruz公司),4oC过夜,加入1:1000稀释的 HRP标记羊抗兔二抗,室温孵育1h,最后在暗室中 进行化学发光法显影.设立不加一抗的阴性对照组, Westernblotting蛋白条带测定吸光度值. 2.4RT—PCR检测肾组织OPNmRNA的表达: 肾组织总RNA提取按Trizol试剂盒(美国Gibico 公司)的说明书进行.紫外分光光度计测定提取的 总RNAA../..值,并经甲醛变性琼脂糖凝胶电 泳鉴定.根据Primer5.0引物软件设计的 OPN引物序列,正义引物:5'-CATCAGAGCCAC— GAGTTTCA一3,反义引物:5一TCAGGGCC— CAAAACACTATC一3,扩增产物为273bp;RT— PCR二步法按TaKaRaRNAPCR试剂盒(大连宝 生物工程有限公司)的说明书进行.取逆转录产物 1OL进行PCR,50ttLPCR体系的反应条件:94 ?3min;94?30S;54?30S;72oC1.5min; 35个循环.同时进行内参照p_肌动蛋白(p_actin) 的PCR,正义引物:5'-CCCAGAGCAAGA— GAGGCTC一3,反义引物:5一AGCACAGCCTG— G'ATAGCAAC一3,扩增产物长度为400bp.取 PCR产物5ttL在1.5%的琼脂糖凝胶中,75V下 电泳,UVP凝胶成像系统照相扫描,测定灰度值,计 算出每个标本OPN与actin的比值来判断各组 中OPNmRNA表达的相对水平. 总体比较采用 2.5统计学分析:数据用?s表示, 方差分析,组间比较采用q检验,用SPSSl1.5统 计软件进行分析. 3结果 3.1一般情况:泽泻大鼠的24h尿量为(25.41-4- 8.17)mL,明显高于对照组的(16.26-4-3.18)mL 和模型组的(13.07-4-4.34)mL,差异显着(P< 0.01).泽泻活性部位对大鼠尿pH值无明显影响 (pH值均在6.40左右).模型组大鼠死亡1只,大 鼠的食量,体重增量均小于其他组,但差异不显着 (P<0.O5). 3.2血清BUN,SCr,24h尿Ca抖,24h尿草酸分 泌量和肾组织Ca抖水平:结果见表1.对照组血清 BUN,SCr,24h尿草酸,24h尿Ca抖,肾组织Ca抖 水平均明显低于其他两组,差异显着;泽泻组血清 BUN,SCr,24h尿Ca抖,肾组织Ca抖水平均明显低 于模型组,差异显着;24h尿草酸分泌量,模型组与 泽泻组间差异不显着. 表13组大鼠血清BUN,SCr,24h尿草酸,24h尿Ca抖和肾组织Ca抖水平(土) Table1SerumBUN,SCr,24hurinaryoxalicacid.andCa抖levelin24hurine andinrenaltissueofratsinthreegroups土) 组别动物/只血清BUN/(mmol?L一)SCr/(t~mol?L,)尿草酸/[nl0I.(24h)一]尿Ca抖/l't~mol?(24h)一]肾组织Ca抖/(mg?g-1) 与对照组比较:…P<0.001;与模型组比较:??P<0.01???P<0.001 …P<0.001ztscontrolgroup:??P<0.01???P<0.001ztsmodelgroup 3.3肾组织病理学检查:PizzllatoS染色后,草酸 钙晶体在光镜下呈黑褐色.模型组大鼠肾组织草酸 钙结晶布满全肾,主要分布在肾乳头和肾皮质,部分 结晶成堆且互相连接成片,高倍镜下晶体主要存在 于肾近曲小管和远曲小管,小管上皮细胞明显肿胀, 变性,坏死,管腔显着扩张;结石经分析表明是草酸 钙结石.泽泻组大鼠肾组织草酸钙晶体明显少于模 型组,仅有少数晶体分布在肾皮质和髓质且晶体大 多散在不成堆,管腔内也仅见散在的草酸钙结晶,扩 张程度也明显比模型组轻. 3.4OPN蛋白的表达:3组大鼠肾组织OPN蛋白 的Westernblotting蛋白条带的值见表2.对照 组肾组织OPN蛋白条带的值均明显低于模型组 表23组大鼠肾组织OPN蛋白及mRNA 的表达水平(土) Table2ProteinandmRNAexpressionofOPNinrenal tissueofratsinthreegroups(土) 组别动物/只OPN蛋白表达(A值)OPNmRNA表达 与对照组比较:,P<0.01…P<0.001 与模型组比较:??P<O.01???P<O.001 P<0.01…P<0.001ztscontrolgroup ?z~p<0.01???P<0.001ztsmodelgroup 和泽泻组,差异显着;泽泻组OPN的值也明显低 于模型组,差异显着. ? 1830?中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月 3.5OPNmRNA的表达:3组大鼠肾组织OPN mRNA的RT—PCR扩增产物电泳结果见图1,OPN mRNA的相对表达水平见表2.对照组肾组织OPN mRNA的表达水平均明显低于模型组和泽泻组,差 异显着;泽泻组OPNmRNA的表达水平也明显低 于模型组,差异显着. Marker 一对照模型择泻 图13组大鼠肾组织OPNmRNA的RT—PCR电泳图 Fig.1ElectrophoregramofRT—PCRofOPNmRNA inrenaltissueofratsinthreegroups 4讨论 尿石症是威胁人类健康的常见疾病之一,草酸 钙结石占尿结石的8O左右,尿结石被摘除或排 出后的复发率很高.随着体外冲击波碎石和腔内泌 尿外科等发展,尿石症的治疗已取得较大的进步,但 目前尚缺乏治疗及预防尿结石复发的有效药物.泽 泻具有利水渗湿功效,可与多种中草药配伍组成治 疗尿路结石的传统方剂.泽泻用于防治尿石症有悠 久的历史和良好的效果,虽已积累了丰富的临床经 验,然而对其作用机制,特别是对其活性成分深入的 基础研究报道甚少.自Yamaguchi等_5报道泽泻的 水提液体外能抑制草酸钙结晶的生长(晶体生长抑 制指数达到8O以上);能显着抑制实验性肾结石 大鼠肾草酸钙结石形成以来,许多学者对泽泻的活 性部位及其防治草酸钙尿石症的作用机制进行了研 究.本实验采用现代植化和生物活性导向分离的方 法将泽泻的有效部位醋酸乙酯浸膏进一步分离得到 几种化合物,通过前期的动物和体外实验逐渐筛选 出泽泻的活性部位,并探讨了其对结石模型大鼠肾 结石形成和OPN表达的影响. 本实验采用1乙二醇和1a一羟基维生素D.ig 诱导大鼠肾草酸钙结石形成.实验结果表明泽泻的 活性部位明显降低肾结石大鼠的血清BUN,SCr, 肾Ca水平和24h尿Ca分泌量,减轻肾小管损 伤的程度;而其对大鼠尿草酸的排泄并没有影响.同 时服用泽泻的大鼠24h尿量明显多于对照组和模 型组,表明泽泻较强的利尿作用也有助于大鼠肾结 石的排出. 正常人尿抑制草酸钙结晶的能力主要依赖于尿 液中的某些蛋白质大分子,它们的浓度及其内在的 抑制能力可显着影响草酸钙晶体的生长和聚集. OPN是一种磷酸化糖蛋白,从正常人尿液中提纯的 OPN在多种浓度下均对草酸钙结晶的生长和聚集 有明显的抑制作用_6],表明OPN可能是正常机体 一 种重要的抑制结石形成的内源性大分子物质.免 疫组化和原位杂交证实OPN主要是由正常肾脏远 曲小管和集合管合成分泌_7].Yasui等_8的研究发 现,正常人肾脏表达OPN较弱,而结石模型组大鼠 OPN的表达明显高于对照组,而结石患者的肾脏和 结石原基质中OPN表达明显增强.本实验也证实 结石模型组大鼠OPN的表达明显高于对照组,而 OPN的过高表达是由大鼠服用乙二醇和1a一羟基 维生素D.后产生的高草酸尿,高钙尿和草酸钙晶体 在肾脏的沉积共同调控所致j.OPN的这种分泌情 况,是机体的一种防御机制,肾脏表达OPN的强度 在一定程度上反映了尿抑制晶体结晶的能力,即通 过合成更多的OPN来抑制结石形成.大鼠服用泽 泻活性部位后,OPN的表达显着降低. 泽泻主要含挥发油,天门冬素,植物甾醇苷,脂 肪酸,树脂,蛋白质,淀粉,三萜类化合物,倍半萜类 化合物,尿苷,大黄素,泽泻醇C一醋酸酯和环氧泽泻 烯等.本课题组将泽泻的活性部位进行初步的核磁 共振谱分析,发现其主要成分是四环三萜类化合物, 它可能通过减少结石大鼠肾组织OPN的表达来抑 制大鼠肾结石的形成,这为阐明泽泻防治草酸钙尿 石症的物质基础及其作用机制和进一步开发生产治 疗尿石症的新药提供了理论依据,有助于科学 泽泻药材及制剂的质量,改进剂型和提高其防治尿 石症的疗效. References: [1]CaozG,LiuJH,WuJz,etd.Effectofdifferentextracts ofAlismaorientalisonurinarycalciumoxalatestoneforma— tioninratsEJ].ChinTraditHerbDrugs(中草药),2003, 34(1):45—48. [2]YezQ,DengYI,DongC.Urolithiasis(泌尿系结石) [M].Beijing:PeoplesMedicalPublishingHouse,2003. 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(1?DepartmentofPharmacology,JiangxiMedicalCollege,Nanchang330006,China:2.Inst ituteofHematology, theSecondAffiliatedHospitalofJiangxiMedicalCollege,Nanchang330006,China;3.Dep artmentof PharmaceuticalScience,JiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine,Nanchang33000 6,China) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofsasanquasaponin(SQS)oninjuryofendotheli alcells inducedbyhypoxia— reoxygenationandneutrophiladhesion,anditspossiblemechanisms.MethodsHu— manumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)wereexposedtonormoxiaorhypoxia— reoxygenationinthe absenceorpresenceofSQS(10.0,1.0,and0.1gmol/L).Lactatedehydrogenase(LDH)activit ywasde— terminedinculturedHUVECsupernatants.HUVECsurvivalrate.neutrophiladhesionrate. malondialde— hyde(MDA)levelsuperoxidedismutase(SOD)andglutathioneperoxidase(GSH— Px)activitiesweremea— sured.NeutrophiladhesionwasassayedinadditionalHUVECtreatedasabove.ResultsTher esults showedthathypoxia— reoxygenationresultedinHUVECinjuryandenhancementofneutrophiladhesion, withtheincreaseinLDHactivity,MDAlevel,andadhesionrateaswell,conversely,withthede creasein activityofSODandGSH—Px;SQSantagonizedthesechangesinaconcentration— dependentmanner.Con— clusionSQSmayprotectHUVECagainsthypoxia— reoxygenationinjuryanditsmechanismappearestobe relatedtoanti—lipoperoxidizationandanti—adhesionofwhitebloodcel1. Keywords:sasanquasaponin;endothelialcells;neutrophils;adhesion;hypoxia— reoxygenation 缺血一再灌注损伤是许多心脑血管疾病共同的 病理过程.已有充分证据表明:中性粒细胞的参与是 缺血一再灌注损伤的关键因素,而血管内皮则是缺 血一再灌注损伤的关键部位.研究表明,细胞在缺 血或缺氧的情况下,将出现能量代谢障碍,引起细胞 内钙超载和氧自由基的产生,并产生细胞因子,激活 收稿日期:2005—03—21 基金项目:江西省自然科学基金资助项目(0140030) 作者简介:黄起壬(1967一),男,江西省南康市人,副教授,博士,研究方向为心血管药理学和分子药理学. Tel:(0791)6360590Fax:(0791)6361693E—mail:huangqr67@163.com