应用嗜热菌蛋白酶快速分离活性纯椭圆囊感觉上皮细胞及其意义

应用嗜热菌蛋白酶快速分离活性纯椭圆囊感觉上皮细胞及其意义 应用嗜热菌蛋白酶快速分离活性纯椭圆囊 感觉上皮细胞及其意义 听力学及言语疾病杂志2006年第l4卷第5期35l ? 实验研究? 应用嗜热菌蛋白酶快速分离活性纯椭圆囊 感觉上皮细胞及其意义* 刘俊孔维佳张亚民张丹 【摘要】目的建立纯椭圆囊感觉上皮细胞(pureutricularsensoryepithelialcell,PUSEC) 的快速分离方法,为内 耳细胞培养及毛细胞再生等机制研究提供大量的活性细胞.方法通过对出生5天大鼠PUSEC的形态,生长特征 的观察,采用透射电镜,紧密联接蛋白(ZO—1),细胞角蛋白,波形蛋白免疫荧光细胞化学,RT—PCR检测毛细胞的 特征性标志物Calretinin,Brn3.amRNA的表达等方法鉴定PUSEC来源.结果PUSEC呈扁平,多角形,核大而圆的 上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时呈"铺路石样"外观.可见由成百个PUSEC包绕液体而成的dome. PUSEC表达ZO—l和细胞角蛋白,不表达波形蛋白,表达毛细胞的特征性标志物Calretinin,Bm3.a的mRNA.结论 PUSEC来源于椭圆囊感觉上皮;纯椭圆囊感觉上皮细胞成功分离为内耳细胞培养及毛细胞再生机制的研究提供 大量的活性细胞;成功分离的关键成份是嗜热菌蛋白酶. 【关键词】嗜热菌蛋白酶;椭圆囊;感觉上皮;细胞培养;毛细胞;再生;支持细胞 【中图分类号】R764.3【文献标识码】A【文章编号】1006—7299(2006)05—0351—04 solationofPureLivingUtricularSensoryEpithelialCellbyUseofThermolysin UuJun,KongWeijia,ZhangYamin,etaI. (DepartmentofOtolaryngology,theUnionHospital,TongjiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,430020,China) 【Abstract】ObleetiveTostudyrapidlycollectedhigh— puritysamplesofhyinghaircellsandsupportingcellsfrominner earandtoinvestigatethemechalliSlTiSofhaircellgenerationorregeneration.MelfrxlsUtricularsensoryepitheliumoflXrstnatal day5(PS)ratswasisolatedbymechanicaldissociation.Theexplantswere~gestedbythermolysin,thentransferredtOanaliquot containingtrypsinandcollagenaseforincubationtoharvestthepureumcdarsensoryepithelialcell(PUSEC).PUSECwascul— taredinDulbeccomodifiedEaglemedium(DMEM).andobserveddailyunderinvertedmicroscope.Theuhrastrcturalexamination withtransmissionelectronmicroscope,immnnofluoreseencemethodwithZO一 1,cytokeratin,vimentin;reversetranscriptionPCR withmRNAofCalretinin,Bm3.awereusedtoidentifytheoriginandcharacterizationofPUSEC.ResultsPUSECshoweda large,flat,polygonalepithelialmorphotypewithbig,roundneuclei.PUSECgrewintomonolayer,"cobblestone—like"apearance. Somecellsshowed"dome"formation.probablyduetofluidcollectionundemeaththecellmonolayer.ThePUSECexpressedZO一 1andcytokeratin18,withoutvimentinexpression,andhadrichmicmvilliandcomplextightjunction,whichin~catedtheepitheli— allloriginationofPUSEC.CoexpressedthemRNAofCalretinin.Bm3.aofhaircellcharacteristicrrIad(ersidentifiedPUSECwere derivedfromucularsensoryepithelium.ConclusionIsolationmethodofpurelivingucularsensoryepithelialcelloftheratsis successfullyestablished.Itissuggestedthatthekeyingredientisthermolysin. 【Keywords】 Thermolysin;Utricular;Sensoryepichlium;Cellculture;Haircells;Regeneration;Supporti ngcells 椭圆囊感觉上皮细胞(utricularsensoryepithelial cell,USEC)的培养已被用于内耳毛细胞发生,发展, 分化,再生机制及各种生长因子对其影响的研究…. *国家自然科学基金(编号39925035),国家杰出青年基金(编号 39925035)和卫生部临床学科重点项目基金(编号2001321)资助 1华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科(武汉4300) 作者简介:刘俊,男,湖北人,副主任医师,博士,研究方向为内耳生理与病理 现在浙江省中医院耳鼻咽喉科. 通讯作者:孔维佳(Emial:weijiak@public.wh.hb.an) 通常原代培养的细胞混有一定数量的杂细胞特别是 成纤维样细胞,纯化时对细胞造成损害,不利于维持 培养细胞的性状L2J.本实验旨在建立纯椭圆囊感觉 上皮细胞(pureutricularsensoryepithelialcell,PUSEC) 的快速分离方法,为内耳细胞培养及毛细胞再生等 机制研究提供大量的活性细胞. 1与方法 1.1实验材料 完全培养基:Dulbecco改良细胞培养基(dulbecco 352JournalofAudiologyandSpeechPathology2006.Vol14.No.5 modifiedeaglemedium,DMEM)(sigma公司)的基础 上加入:2mmol/LL一谷氨酰胺(日本,上海分装), 100ng/ml表皮生长因子(epidermalgrowthfactor, EGF)(sigma公司),9rng/ml葡萄糖,0.4mgm氢化可 的松,100u/nll青霉素,2.5g/L二性霉素B,青霉素 (华北制药厂),最后加入5%胎牛血清(fetalcall" $eUlTI~FCS),10%马血清(horse$erllm,HS)(Sigma Co.),20mMHEPES(RocheC0.),pH:7.0,7.2. 条件培养基:完全培养基培养细胞后,经0.22tma 微孑L滤膜过滤,再与完全培养基按1:2体积比混合. 消化液组成:0.5mg/n~嗜热菌蛋白酶(thermoly. sin)(sigmaCo.),0.25%的胰蛋白酶和0.25%胶原酶 按1:1体积比混合,0.25%胰蛋白酶(Sigma分装)和 0.O1%乙二胺四乙酸钠(EDTA)按1:1体积比混合. 0.5m#ml右旋多聚赖氨酸,用于包被免疫组织 化学的盖玻片,以利于组织块及细胞贴附.具体如 下:经无菌处理的盖玻片在右旋多聚赖氨酸溶液中 浸泡3,5min,无菌三蒸水冲洗,备用. 兔抗紧密联接蛋白(zO一1)多克隆抗体(Zymed Co.),小鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体,小鼠抗波形 蛋白单克隆抗体(LabvisionCo.),FITC标记山羊抗小 鼠IgG,FITC标记山羊抗兔IgG(PierceCo.)(USA). Trizol购自GibcoCo.(USA),CDNA第一链合成 试剂盒均购自Ferment,as公司,TaqDNA聚合酶, dNTP混合物(SigmaCo.),DL一2000(TaKara),焦磷 酸二磷酸酯(DEPC),琼脂糖(Spainsh). 1.2实验方法 1.2.1纯椭圆囊感觉上皮细胞的获取及培养 出生5天(postnatalday5,P5)的Wistar大鼠每次 10只,体重约25g(华中科技大学同济医学院实验 动物学部提供),雌雄不拘.戊巴比妥钠腹腔麻醉 (100mg/kg),75%酒精浸泡5分钟,Hank液(含10呋 双抗)冲洗.无菌台上沿头颈相接处断头,取颞骨, 在解剖显微镜下,用尖针及显微镊取出椭圆囊上皮 Calretinin Bm3.a 大鼠B—aetin作为内参照 片放入0.5mg/ml嗜热菌蛋白酶中37?消化30min 后,加入Hank盐溶液,椭圆囊上皮片(仅包括毛细胞 和支持细胞)上浮,修剪上皮片周边组织仅保留椭圆 囊微纹区(所有解剖操作都在冰上进行).取出纯椭 圆囊上皮片置人0.125%的胰蛋白酶+0.125%胶原 酶37oc~化8min并轻柔吹打获取PUSEC,800转/min 离心8分钟去上清,Hank液漂洗两次,完全培养基重 悬,接种于培养板,细胞个数不少于1×lO5个/ml,5% Co2/95%空气,37~C培养箱中培养.每天在倒置显微 镜下观察培养基的颜色,透亮度,视细胞生长情况,每 周用条件培养基换液12次,达80%融合度时,采用 0.02%EDTA+0.125%胰酶消化爬片或传代. 1.2.2PUSEC的透射电镜观察 培养PUSEC达到8D%融合后,加0.%的EDTA+ 0.125%胰蛋白酶消化11300转/min离心10分钟,2.5%戍 二醛固定1小时,按透射电镜制作程序进行观察,拍片. 1.2.3培养细胞ZO一1,细胞角蛋白18及波形蛋 白免疫荧光细胞化学观察(在所有实验中,仅加入一 抗或二抗的对照组也进行了观察) 培养PUSEC80%融合时,采用0.02%EDTA+ 0.125%胰蛋白酶消化,按1×lO'/ml接种于盖玻片, 爬片.细胞形成单层时,取出玻片,0.O1MPBS冲洗 一 遍;4%多聚甲醛固定30min,PBS洗3次;10%正 常羊血清封闭抗原15min;加一抗:ZO一1(1:100), 细胞角蛋白(1:50),波形蛋释白(1:100),4~C过夜, PBS洗三次;,加二抗为F1TC标记山羊抗小鼠IgC (1:100)或FITC标记山羊抗兔IgC(1:100),室温孵 育30min,PBS洗三次;缓冲甘油封片,观察,拍片. 1.2.4RT—PCR检测PUSEC毛细胞特征标记物 Calretinin,Bm3.amRNA的表达 ?总RNA提取(Trizol法)及CDNA第一链合 成,过程参照说明书,所有操作在冰上完成. ?聚合酶联反应(PCR)引物序列如下(由上海 生工公司合成): 5一GCGCAGATCCI?CCAACCGA一3 5一TrACAI1GGGGCCCTCACI?C一3 5一CCATGCGCCGAGTr兀兀?C一3 5一CI?CACATCGCI?AGACACGC一3 5一CA1TrGTAACCAACrcACG一3 5一GAGGCATACAGGGACAACA一3 反应体系:10×Buffer2l,MgC121.2l,10mM dNTP0.5l,上游引物(P)0.5l,下游引物(P2)0.5 l,模板DNA2l,Taq聚合酶0.5l,三蒸水12.8 l,总体积20l. 反应条件为Calretinin扩增条件:95?,5rain,(95? 30s,59?30s,72?35s)×35循环,72?10min,4~C保 扩增片段长度553bp 扩增片段长度434bp 扩增片段长度212bp 存.Bm3.a扩增条件:95?,5min,(95?30s,60?30 s,72?35s)×35循环,72?10min,4?保存.J3一actin 扩增条件:95?,5min;(94?,30s;54~C,30s;72?,45s) ×35循环,72?,10min,4~C保存. PCR产物琼脂糖凝胶电泳紫外线观察拍片. 2结果 听力学及言语疾病杂志2006年第14卷第5期353 2.1纯椭圆囊上皮片及纯椭圆囊感觉上皮细胞获取 在倒置显微镜下观察到,应用嗜热菌蛋白酶处 理椭圆囊上皮片获得纯椭圆囊上皮片(图1)及应用 0.125%的胰蛋白酶+0.125%胶原酶消化获得纯椭 圆囊感觉上皮细胞及细胞团(图2). 2.2PUSEC细胞的生长特征及形态特征 纯椭圆囊上皮细胞种植于培养板,在倒置显微 镜下观察,2h后可见细胞可贴壁.24h后细胞开始 分裂生长.培养4,5天,细胞可达80%融合,可见 一 些细胞变圆浮起,可能为变性坏死的毛细胞.一 周后细胞形成单层,呈'铺路石'样,细胞胞体较大, 多角形,扁平,呈上皮细胞形态(图3),可见由数百 个PUSEC形成的"dome"结构(图4).未见成纤维样 细胞(fibwbl~tlikecells,FLC)生长. 透射电镜可见类似于紧密连接样结构,单个细 胞表面有微绒毛,胞浆内线粒体,内质网丰富,表明 细胞功能活跃(图5).在电镜观察中未见到毛细胞 的特异结构纤毛束. 2.3细胞ZO一1,细胞角蛋白及波形蛋白免疫荧光 细胞学观察 ZO一1为胞膜染色模式:阳性表现为胞膜紧密 连接处绿色荧光.细胞角蛋白和波形蛋白为胞浆染 色模式:阳性可见胞浆绿色荧光;阴性对照无荧光. PUSEC表达上皮细胞特异性标志物ZO一1(图 6)和细胞角蛋白(图7),不表达波形蛋白质(图8), 表明其为上皮细胞来源. PCR检测发现PUSEC表达Calretinin, 2.4RT— Brn3.a蛋白mRNA 以Calretinin为引物扩增出一条带,在750bp至 500bp之间与553bp相符,为Calretinin;以Brn3.a 为引物,扩增出条带在500bp至250bp之间与434 bp相符,为Bm3.a(图9).阳性对照为大鼠耳蜗 Corti器组织.内对照B—atin大小为212bp.阴性 对照未见条带. 3讨论 3.1纯椭圆囊感觉上皮的获取 大鼠椭圆囊感觉上皮由中心区(微纹区感觉上 皮)及周围区(边缘区)组成,微纹区的感觉上皮主要 由毛细胞(工,?型毛细胞)和支持细胞组成.通常 原代培养的细胞混有一定数量的杂细胞特别是成纤 维样细胞,细胞纯化是原代细胞培养中面临的最大 问题.细胞培养中常用的纯化方法有-2]:?机械刮 除法;?反复贴壁法;?消化排除法.此外还有低血 清培养法,反复块法等.本实验利用嗜热菌蛋白酶 特异消化作用,获得纯椭圆囊感觉上皮.其作用机 理是_3]:嗜热菌蛋白酶水解蛋白与疏水氨基酸的氮 端相接合,在37':C作用30min后,连接于支持细胞 基底部组织被分解,而由毛细胞和支持细胞组成的 感觉上皮作为一个整体在盐溶液中上浮,粘附于感 觉上皮边缘的非感觉上皮被分开,得到纯椭圆囊感 觉上皮,不含成纤维样细胞等,避免了细胞纯化时对 细胞造成的损害,有利于维持培养细胞的性状.而 成熟毛细胞不能耐受反复消化传代,不能分裂增殖, 随着培养时间的延长会变圆浮起,死亡-4J.由支持 细胞和毛细胞组成的纯椭圆囊感觉上皮,只表达上 皮细胞特征性标记物及毛细胞特征性标记物,不表 达成纤维细胞标记物与本实验结果一致. 3.2纯椭圆囊感觉上皮细胞来源的鉴定 椭圆囊感觉上皮细胞由毛细胞和支持细胞组 成,支持细胞为上皮细胞来源.在倒置显微镜下,培 养细胞表达上皮细胞特有标记物ZO一1和细胞角 蛋白,不表达波形蛋白_5].本实验培养的多角形, 扁平,连接紧密的细胞表达情况与以上结论相符,表 明是上皮来源细胞.PUSEC单层时有dome形成, dome是由上百个USEC包绕液体形成的球形结构. 其产生的机理是由于单层USEC极性排列,细胞之间由紧密连接构成屏障(电镜观察可见),水随着跨 上皮主动转运的离子流穿过细胞体,由于培养皿基 底不能通透离子或水分,液体在USEC层和皿底之 间积聚,表现为镜下折光性强的泡样结构.dome的 形成间接证明了上皮细胞的特征性结构:细胞连接 复合体的存在,即培养细胞是上皮细胞来源]. 毛细胞的特征性标志物较多J,如Calretinin, Calmodulin,Oncomodulin,Brn3.aMyosinVIIaAchRa9 等.本实验应用RT—PCR检测发现PUSEC表达 Calretinin,Brn3.a蛋白mRNA.Calretinin_1..是一种钙 联蛋白,在毛细胞正常发生,发展,分化的过程中, Calretinin可以作为耳蜗及前庭毛细胞再生的早期标 志物.在内耳感觉上皮毛细胞分化和再生的早期阶 段,被用来区分毛细胞及支持细胞或者确认尚存活 的亚致死性损伤的毛细胞.在成熟的椭圆囊毛细胞 其表达下调,在成熟的耳蜗表达于内毛细胞而外毛 细胞不表达.而Brn3.a…是内耳感觉上皮正常发 育所必需调控因子,它涉及毛细胞最初分化过程的 调控,在耳蜗及前庭毛细胞中高表达.敲除Brn3.a 基因的小鼠可导致毛细胞缺失,引起耳聋.PUSEC 表达毛细胞特征性标记物Calretinin,Bm3a蛋白mR. NA,表明PUSEC源于椭圆囊感觉上皮. 在倒置显微镜及透射电镜下,未见到毛细胞的特 异结构纤毛束.毛细胞静纤毛束的形成可能要求更完 整的三维结构,耳蜗器官培养,生长因子及其连接组织 (下转第362页) 362JournalofAudiologyandSpeechPathology2006.Vol14.No.5 血以外,不会造成严重的后果,而出血也是完全可 以处理的J.SA在相当一部分的动物中持续存在, 特别是在啮齿动物大鼠,小鼠和沙鼠中,它起源于颈 内动脉,向腹侧进入鼓室腔,沿耳蜗的基底转走向镫 骨,在镫骨的足弓间穿过J.许多作者曾强调,为 了保护听力甚至维持动物的生命,sA必须保 留?J,实验中,在电凝SA后,所有的动物都得到 存活,且电凝SA的一侧的耳蜗的结构未受到影响. ABR测试的结果表明,电凝的前后,在0.5,16kHz的 频率范围内,ABR的阈值无明显的统计学差异.由于 设备所限,我们不能测试更高频率区域的听力,由于 正常听力的大鼠的可听频率范围在1000,50000Hz, 因而,无法了解该方法是否会对更高频率的听力产生 影响.但在sA被电凝的一侧,在耳蜗的各回,包括 sA被电凝侧的高频区(基底回)Corti器(内毛细胞,外 毛细胞和支持细胞)的存在,SGN及其周围突的存活, 都表明高频听力丧失的可能性比较小. 眼眶的血液供应几乎全部来源于SA,它发出了 同侧的眼动脉和泪腺动脉,因而,电凝SA会引起对 同侧的眼的功能的关注.尽管仍需要进一步的研究 证实,但在本研究期间,在治疗组中,我们没有发现 任何一只动物有视觉缺陷的迹象. 4参考文献 lPraetoriusM,LimbergerA,MullerM,eta1.Anovelmicropeffusion systemforlongtermlocalsupplyofdrugstotheinnerear..implantation andfunctionintheratmodel[J].AndiolNeurontol,2001,6:250. 2Yonmn~toH,TomingarmM,SoneM,eta1.Contribuationofstalal arterytobloodflowinthecochlearanditssurroundingbone[Jj.Hear Res,2003,186:69. 3Ar~joMF,OliveimCA,SesanaWE,eta1.RadiologyqIlizcasel: persistantstapedialartery,leftear[J].ArchOtolaryngolHeadNeck Surg,2OO2,128:456. 4GovaertsPJ,MarquetTF,CremersWR,eta1.Persistentstap~alal"一 tery:doesitpreventsuccessfulsurgery[JJ.AnnOtolRhinolIa, 1993,102:724. 5PinilaM,namirez—CamachoR,JorgeE,eta1.Ventralapproachto theratmiddleearforotolngicresearch[J].OtolaryngolHeadNeck Sttrg,2001,124:515. (本文图2见插图第5—2页) (2006—08—07收稿) (本文编辑周涛) (上接第353页) 对毛细胞的成熟可能是必需的[5J,联合培养PUSEC 及其连接组织,可能有利于PUSEC分化为毛细胞并 形成纤毛束,目前认为毛细胞前体为支持细胞?. 4参考文献 1LawlorP,MarcottiW,ladvoltaMN,eta1.Differentiationofmammalian vestibularhaircellsfromconditionallyimmortal,postnatalsupporting cellslJj.JNeur?ci,1999,19:9445. 2鄂征,主编.组织培养和分子细胞学技术[M].北京:北京出版 社,2001.120,134. 3CorwinJT,FinleyJE,SailerR,eta1.Isolationofpurelivinghaireel epitheliabyuseofthermolysin[J].AssecResOtolaryngolAbstr, 1995,l8:87. 4Zheng几.LewisAK,GaoWQ.Establis~mofconditionallyinm~r— talizedratutricularepithelialcelllinesusingaretrovirus—mediated genetransfertechnique[Jj.HearRes,1998,117:13. 5Zheng几,HelbigC,GaoWQ.Inductionofceilproliferationbyfibro— blastandinsulin—likegrowthfactorsinpureratinnerearepithelial cellcultures[Jj.JNeuresci,1997,17:216. 6ZhaoHB.Long—termnaturalcultureofcochlearsensoryepitheliaof guineapigs[J].NeuroecienceLetters,2001,315:73. 7ChunYM,MoonSK,LeeHY,eta1.Immortalizationofnormaladulthu— rnanmiddleearepithelialceilsusingaretroviruscontainingtheE6/E7 genesofhumanpapiilomavirustype16[J].AnnOtolRhinolLaryngol, 2002.1ll:507. 8武忠弼.主编.病理学[M].第四版.北京:人民卫生出版社, 1999.15,27. 9OzekiM.DeanL,HamajimaY,eta1.Establishmentandcharacteriza— tionofratprogenitorhairceillines[J].HearRes,2003,179:43. 10ZhengJL,GaoWQ.Analysisofratvestibularhaircelldevelopment andregenerationusingcalretininasanearlymarker[J].JNeuresci, 1997,17:8270. 1lKeithleyEM,EnkmanL,Bem~ettT,eta1.Effectsofahairceiltran— scriptionfactor,Bm3.1,genedeletiononhomozygousandhetem~ygous rrmusecochleasinadulthoodandaging[Jj.HearRes,1999,134:71. 12AlgrangeB,BelachewS,ThiryM,eta1.Proliferationgenerationof mammalianauditoryhairceilsinculture[J].MechanismsofDevelop— ment.2002.112:79. (本文图l,9见插图第5一l页) (2006—02—05收稿) (本文编辑雷培香) 防晕帽抗前庭自主神经反应效果观察 舍人神经营养素5的重组腺病毒的高效制备 譬0$葛.(im.n,4h.4t.gD293?;#:I鼍IIIOh411.AI;m稿j4I意出,州 目褂州M:D1,2tl(l1)MarKer圈 2 川席 ?肚h丛陶l1l?:?卜1毒. AD2931hA(1eas~\'IarKer: 2AD293pshtieIRES]I4pAdeasyIII'?眦hj【lll'幢粗;轱啦1ET"}一IjJ 应用嗜热菌蛋白酶快速分离活性纯椭回囊感觉上皮细胞及其意义 一 0一一___!_,j羞孽篓子雾湖 ?一日董图1"测霞f镜下黼闻礁感觉I皮II(】Ilf1) 图2恻性显僦谎FNi氍屯l缃肌嚏细胞13<11T~IIll[) 图3怖厨】蟥出站细临.L【t特fiEfJ'il荫谳镜.什三茂把层日J自l1路r『 图4慵到艇啦社l崖…【:特f_rm镜l1虑纳帆层?十~d,ome筘 图5州【让Is'~~lll胞J虚时ILA~{rT.嚓结卸】表面仃6-E,胞lq厩栈枉 图6精许椭姑世fZOI蠢1々t?L皑牲菠染色'n《×25(I) 圈7墙岸椭ir,lI馒畦I应圳0肛加鹾自丧清,饱崆荧光色呈(!州j 图8墙荠椭r鞋感啦I庄flil,r~~靠仆三蚩青r见渡聒蛋白水表进.见悭蜒光'壮包I[JI 圈g地椭同斑感施J—,性LalretiMn?n刖,PCR产物电泳结粜13NA廿 为01物增卅祭带证7nl1l】500hp之州553hp佴许匈Calrul3lltrj 2'~iillj之与434bll棚什,Bi…u3.24{}剖为几鼠蚺觉I世组织Calrct a(u凡小9.1212h 插图5一 !" 市甫.精崭堙接样(x6300 ,25n1 际准fDI2111K1)10aIreUl~i] 3a为Il拗扩增mH舞带庄500hI) 】}的对内肿【