[word doc]快速检测牛巴贝斯焦虫LAMP方法的建立

[word doc]快速牛巴贝斯焦虫LAMP方法的建立 快速检测牛巴贝斯焦虫LAMP方法的建立 第32卷第10期 2010年10月 中国预防兽医 ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine VO1.32.N0.10 0ct.2010 doi:10.3969~.issn.1008—0589.2010.10.09 快速检测牛巴贝斯焦虫LAMP方法的建立 李群,王素华,周前进,蔡渭明,杜爱芳 (1浙江大学动物科学学院农业部动物疫病病原学与免疫控制重点开放实验室,浙江杭州310029 2.温州出入境检验检疫局,浙江温州325000;3.绍兴出入境检验检疫局,浙江绍兴312000) 摘要:为提高牛巴贝斯焦虫(Babesiaboris)病检出率,本研究采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快 速,灵敏,特异的检测B.boris的方法.根据GenBank中登录的B.boris细胞色素b基因(cytb)序列,设计4条 LAMP引物,优化反应体系条件,在BstDNA聚合酶的作用下,62?反应60rain,加入EvaGreen后,肉眼观测. 结果表明,该LAMP检测体系特异性强,与双芽巴贝斯焦虫 (B.bigemina)DNA等不发生交叉反应;敏感性高, 最小检测值为0.014fg(相当于1.58×l0.虫体的拷贝数),为一般PCR方 法的1000倍.该方法具有简单,快速, 低成本的特点,可用于B.bovis病的现场快速检测. 关键词:牛巴贝斯焦虫;环介导等温扩增技术 中图分类号:$852.7文献标识码:A文章编 号:1008—0589(2010)l0—0781—04 RapiddetectionofBabesiabovisbyloop—mediated isothermalamplification LIQun,WANGSu—hua2#,ZHOUQian-jin,CAIWei-ming,DUAi—fang r1.KeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiology&ImmunologicalPreventionofMinistryofAgricultural,CollegeofAnimalSciences ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China;2.WenzhouEntry—exitIns pectionandQuarantineBureau,Wenzhou325000,China; 3.ShaoxingEntry—exitInspectionandQuarantineBureau,Shaoxing312000,China) Abstract:Aloop—mediatedisothermalamplification(LAMP)assayforrapiddetectionofBabesiaboviswasdevelopedusing primersspecifictosixdistinctregionsofCytochrome6geneofBabesiabovis. LAMPwasperformedusingBstDNApolymerase at62? inawaterbathfor60minandamplificationresultswasvisualizedwithEvaGreen I.Specificbandscouldbedetectedfor Babesiabovis,butnotBabesiabigemina.Thedetectionlimitoftheassaywas0 .014LforBabes&bovis,whichwasupto 1,000timeshigherthanthatofPCR-basedmethods.TheLAMPmethodwasra pidandcouldbeeasilyperformedatalowcost. Keywords:Babesiabogis;loop—mediatedisothermalamplification(LAMP) 巴贝斯虫是一类经蜱传播,红细胞内寄生的原 虫,属于复顶亚门.由该类寄生虫引起的巴贝斯虫 病,呈世界性流行,给畜牧业造成重大损失….在 所有巴贝斯虫中,牛巴贝斯焦虫(Babes&boris)致病 性最强,是引起热带和亚热带地区牛巴贝斯虫病的 *Correspondingauthor;#Equalcontributor 主要病原.我国已有l4个省(区)报道该病流行,主 要为南方各省.牛感染该虫后,出现贫血,发热, 血红蛋白尿,共济失调等症状,严重u,-j,~l起死亡. 目前,检测B.boris病的方法包括血涂片镜检, 血清学检查,常规PCR检测,反向线性斑点杂交技 收稿日期:2009—12—25 基金项目:国家质检总局科技计划项目(2009IK007) 共同第一作者:李群(1986一),男,山东潍坊人,硕士研究生,主要从事 动物疾病预防与控制的研究; 王素华(1975一),女,山东聊城人,兽医师,主要从事进出境动物和动物 产品的检验检疫 通信作者:E-mail:afdu@zju.edu.ca 中国预防兽医 术(RBL)以及PCR-ELISA等,但是这些方法存在敏 感性低,交叉感染,假阳性率高等缺陷,有些方法 如实时定量PCR技术成本高.本研究根据LAMP的 基本原理【,针对cytb基因的6个特异性区域,设 计4条引物,建立一种简便,高效,实用的DNA 检测方法【,该方法可用于B.boris病早期诊断,拥 有较好的应用前景. 1材料和方法 1.1虫体DNA及主要试剂B.boy括DNA由中国 农业科学院兰州兽医研究所惠赠;BstDNAPoly. merase购自纽英伦生物技术(北京)有限公司;甜菜 碱购自Sigma公司;100bpDNAMarker,dNTP和 限制性内切酶ApaI均购自TaKaRa公司;荧光染 料EvaGreen购自上海英骏公司. 1.2B.bovisDNA的提取取200IxL牛的无菌抗 凝血液,加入100I.zLTRIzol试剂,充分混匀后加入 等体积的Tris饱和酚/氯仿混合液抽提2次,上清 用2倍体积的无水乙醇沉淀2h或过夜,70%的乙 醇洗涤后自然干燥,沉淀用20IxLTE缓冲液溶解 后,4?保存备用. 1.3B.bovisLAMP方法的建立 1.3.1引物设计参照GenBank中登录的B.bovis cytb基因序列,应用生物软件分析,并利用在线 PrimerExplorer3.0软件在cytb基因的特异区域筛 选4条引物(外引物:F3/B3和内引物:B1P/FIP).对 设计的引物进行在线BLAST分析,确定为B.bovis cyt6基因的特异性引物,序列为:F3:5’-GGT TGGGCAATGCGTTAT.3’和B3:5’-TGTCCGTAAGG AAGAACAT.3’;FIP:5’-CACAATCCCTTTAGCATA TGTAGCAGGGCCCTTTCACGCTCAATGTGTTTC一3’ 和BIP:5’-GTACTCAAGCAGATATCTACCATGGG GGCCCAACCTAAGAAAGCAATAGCCATA一3,引物 由上海生工生物服务有限公司合成. 1.3.2反应体系的建立及条件优化以B.boviscytb 基因为对体系进行优化.分别对M浓度 (Ommol/L,8mmol/L),dNTP浓度(0.2mmol/L, 1.6mmol/L)和温度(58?,68?)进行优化. 1.4B.boviscytb基因PCR检测方法的建立20L PCR反应体系为:10XPCRBuffer2IxL,dNTP 1.6L,F30.4lxL,B30.4IxL,模板1ILL,rTaq 0.15IxL.PCR程序:94?3min:94?45S,52.9? 90S,72?70S,30个循环;72?10min.PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测. 1.5LAMP特异性试验分别将B.boris,牛瑟氏 泰勒虫(BovineTheileriasergen~),马泰勒焦虫 (Babesiamarte1),弓形虫(Toxoplasmaqondii),羊泰 勒虫(SheepTheHena),双芽巴贝斯焦虫(B.bigemina) 的DNA作为模板,按建立的LAMP检测方法进行 扩增,并加入EvaGreen染料观察并进行琼脂糖凝胶 电泳分析. 1.6LAMP敏感性试验以已知浓度B.boriscytb 基因为模板,10倍梯度稀释,进行LAMP反应,加 入EvaGreen染料观察并进行琼脂糖凝胶电泳分析. 1.7重复性试验取一个阳性样品和两个阴性样 品,提取DNA并进行LAMP扩增,重复3遍,检 测方法的重复性. 1.8序列分析LAMP反应产物经1%的琼脂糖凝 胶,利用DNA割胶回收试剂盒将约200bp的条带 回收DNA并进行TA克隆.序列由上海生工生物技 术服务有限公司测序. 1.9对现地样品的检测在浙江某地区牛场随机采 取24份样品,进行LAMP检测. 2结果 2.1反应体系的优化经试验验证,确定最优反应 体系确定为:1mmol/LFIP,1mmol/LBIP,0.2mmol/L F3,0.2mmolfLB3,4mmol/LMgSOa,0.8mmol/L dNTP,0.8mmol/Lbemine,10XLAMPBuffer,1L DNA模板,8UBstDNA聚合酶,灭菌蒸馏水补足. 62?水浴60min,80?5min终止反应.将扩增产 物中加入1:10稀释的EvaGreen1L,观查颜色变 化,琼脂糖凝胶电泳观察结果. 2.2特异性试验结果特异性试验结果显示,以 B.boris的DNA为模板扩增出特异性条带,并且与 预期产物序列一致,而与牛瑟氏泰勒虫基因组 DNA,马泰勒焦虫基因组DNA,弓形虫基因组 DNA,羊泰勒焦虫基因组DNA和双芽巴贝斯焦虫 基因组DNA反应均为阴性(图1).表明LAMP反应 特异性良好. 2.3敏感性试验结果经检测,B.bovisDNA浓度 为14pg/~L,将其进行10倍梯度稀释,应用PCR 第10期李群,等.快速检测牛巴贝斯焦虫LAMP方法的建立 检测显示体系中检测的DNA量为14绝(图2);而 应用LAMP方法进行扩增,最低可检测到DNA含 量为0.014fg(相当于1.58×10.虫体的拷贝数)(IN3). M1234567 500bp 200bp 100bp M:100bpDNAMarker;1-6:B.bovisDNA,BovineT.sergentiDNA, B.martelDNA,T.gondiiDNA, SheepTheileriaDNAandB.bigeminaDNA;7:Negativecontrol 图1特异性试验结果 Fig.1The~eeifieityofPCRtcstandEwGreenstaining M123456 500bp 200bp 100bp M:100bpDNAMarker;1-5:14×10fg.1.4×10fg,14X10.fg 14fgand1.4fgB.bovisDNArespectively;6:Negativecontrol 500bp 200bp 100bp 图2PCR敏感性试验结果 Fig.2TheseasitivityofPCRtest Ml2345678 ? “1 三Jl2345678 M:100bpDNAMarker;1-7:1.4×10fg,1.4×10’fg,1.4fg, 1.4×10,fg,1.4×10.fg,1.4×10.fgand1.4×10fgB.bovisDNA 8:Negativecontrol 图3LAMP敏感性试验结果 Fig.3ThesemitivityofLAMPtest姐dEvaCaeenstainin~ 2.4重复性试验随机选取3个样品,进行LAMP 扩增,琼脂糖凝胶电泳显示,在200bp左右扩增出 目的片段,其中样品A为阳性,B和c为阴性.重 复操作3次,结果完全一致(图4). 2.5现地样品检测结果对浙江某地区牛场随机采 样检测,在24份被检血样中检出l份阳性,阳性率 为4.2%(图51. 500bp 200bp 100bp 783 MA1B1C2A2B2C2A3B3C3 M:l00bpDNAMarker;AI—C1:Productsofthefirstroundof LAMPreaction;A2一C2:ProductsofthesecondroundofLAMP reaction;A3一C3:ProductsofthethirdroundofLAMPreaction 图4重复性试验结果 Fig.4RepeatabilityoftheLAMPsystem M1234567891011121314l516171819202122232425 M:100bpDNAMarker;1-24:24bloodsamples,respectively 25:Positivecontro1 图5现地样品检测结果 Fig.5Thedotoctcdrosultaofbovinesamples 3讨论 目前,诊断巴贝斯虫病主要是血涂片镜检技 术,该方法简便,快捷,但对涂片染色技术要求 高,敏感性低,不能用于外周血内寄生虫含量较低 的动物_5】及感染耐过的带虫动物的检测;巴贝斯焦 虫不同种之问形态相近,因此形态学鉴别较困难; 血清学方法主要用于流行病学研究,该方法不肯区 别动物处于感染阶段还是已经耐过,不能确定可能 引起的交叉感染,也不能准确鉴定带虫动物以及贮 存宿主】.Buling等以cytb基因作为靶基因,建立 的定量PCR方法能够从含有0.1ng,0.1B.boris DNA的样品中检测到虫体的存在;Mclaughlin等 建立的套氏PCR技术能够检测2.0Pg的B.borisDNA 样品[91.本研究针对B.borisb基因特异区域设 计4条引物,建立的LAMP检测方法,最低检测值 为0.014fgB.bovisDNA,敏感性比普通PCR高. 该病在DNA水平上的诊断,通常选择18S rRNA基因作为扩增的靶基因,而18SrRNA在巴贝 斯属焦虫的基因组中拷贝数较低.Dalrymple等研究 —UOO如加m 784中国预防兽医2010拄 发现B.bovis的基因组中,小核糖体亚单位基因的 拷贝数只有3个[10],而Kibe等发现同为梨浆虫的小 泰累尔梨浆虫的基因组中也仅有两个拷贝…].疟原 虫『l2】和小球隐孢子虫[n】只有4个,5个拷贝.以 PCR扩增为基本技术,基于DNA水平的分子诊断, 敏感性与靶基因扩增的数目密切相关,选择一个在 基因组中高拷贝数的基因作为靶基因将会大大提高 现有PCR方法的敏感性.Salem等报道,利用cytb 基因作为靶基因建立的PCR方法检测B.bovis和双 芽巴贝斯焦虫,要比利用18SrRNA作为靶基因建 立的方法灵敏20%_l4].因此,本研究选择cytb基 因作为靶基因建立LAMP检测方法. 本实验结果显示,采用B.boviscytb基因的特 异区域设计引物,能够准确识别B.bovis的特异性 片段,提高了该检测方法特异性.敏感性试验进一 步证实该LAMP方法效果良好,敏感性高于一般 PCR检测方法,能够准确鉴定出0.014fg的B.bovis. 该方法成本低廉,仪器要求简单,耗时短,结果判 定简单,特异性和灵敏度高,可满足临床检测的需 要,有较好的应用前景. 参考文献 [2] 【3] [4】 肖冰冰,肖凯军,石磊,等.LAMP方法在食品微生物检测 中的应用【JJ.现代食品与药品杂志,2007,17(1):22—25. 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