乳铁蛋白-聚合物泡囊载S14G-Humanin肽对Amyloid-β 25-35诱导的阿尔茨海默病模型大鼠的神经保护作用

乳铁蛋白-聚合物泡囊载S14G-Humanin肽对Amyloid-β 25-35诱导的阿尔茨海默病模型大鼠的神经保护作用 俞媛1，冯亮2，高会乐2，蒋新国2*（1第二军医大学药学院药剂学教研室 上海 200433，2 复旦大学药学院药剂学教研室 上海 200032） 摘要：目的 构建以乳铁蛋白作为靶向功能基、可生物降解聚合物泡囊为载体的脑靶向递药系统，并对其脑部递药特性作出药效学评价。方法 制备载神经肽S14G-Humanin的乳铁蛋白－聚合物泡囊并对其进行征，建立大鼠阿尔茨海默病模型，采用Morris水迷宫试验评价载药系统对大鼠记忆认知障碍的改善。 结果 聚合物泡囊粒径约126nm，zeta电位-2.54mV，包封率21.78%，药效学实验表明，载S14G-Humanin的聚合物泡囊能够显著改善大鼠的记忆缺陷，同时对Amyloid-β 25-35诱导的Bax蛋白的过量表达具有抑制作用。结论  乳铁蛋白连接聚合物泡囊载药系统能够对多肽药物起到保护作用，提高药物的治疗效果，本递药系统具有较好的脑内递药特性。 关键词：聚合物泡囊 乳铁蛋白 阿尔茨海默病 中图分类号:   文献标识码:  　文章编号: Lactoferrin Conjugated self-assembled Polymer vesicles loaded S14G-Humanin, prevents Amyloid-β 25-35 induced memory impairment in rats YU Yuan1, FENG Liang2, GAO Hui-le2, JIANG Xin-guo2* (1 Department of Pharmaceutics , School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433; 2 Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032) ABSTRACT: OBJECTIVE　To prepare a novel brain targeting system, lactoferrin conjugated self-assembled polymer vesicles(Lf-PVs), which the brain delivery property had been evaluated in vivo. METHODS S14G-Humanin (S14G-HN) as a neuroprotective peptide was entrapped within Lactoferrin conjugated self-assembled polymer vesicles by an ammonium sulphate gradients method. The Lf-PVs were characterized for shape, size, electrical charge and entrapment efficiency. The vivo effect of Lf-PVs contained S14G-HN was examined on amnesia induced by Amyloid-β 25-35 in rats. RESULTS　The Lf-PVs had a round and vesicle-like shape with a mean diameter around 126 nm by direct cryogenic temperature transmission electron micrograph (Cryo-TEM) and a negative electrical charge(-2.54mV). Coupling of Lf with PVs was confirmed by immuno-gold labeling of Lf visualized under the TEM. The drug entrapment efficiency is 21.78%. S14G-HN encapsulated into Lf-PVs could protect latent learning as well as spatial working memory and inhibit the over-expression of Bax protein in Amyloid-β 25-35 treated rats. CONCLUSION The Lf-PVs may provide a promising carrier to deliver peptide across the BBB for the treatment of brain infection. KEY WORDS: polymer vesicles; lactoferrin; Alzheimer's disease 中枢神经系统疾病是危害人类健康的一大类疾病，而血脑屏障(blood-brain barrieer,BBB)限制了大多数化学药物、多肽药物和基因药物的脑内转运，使药物无法自主进入脑部。因此具有脑内靶向递药作用的新型药物传递系统得到广泛研究，其中尤以通过受体介导转运入脑的微粒递药系统的研究最为成功[12,13]。乳铁蛋白（lactoferrin, Lf）是一种多功能蛋白，主要用于调节内环境离子稳定、抗微生物感染、调节细胞生长、增强免疫等，其生理功能通过乳铁蛋白受体介导进入细胞来实现[9]，有研究表明脑部有乳铁蛋白受体的表达。聚合物泡囊（Polymer Vesicles, PVs）是一种新型载药系统，由具有两亲性质、可生物降解的聚合物分子自组装而成，结构类似于细胞膜的双分子层，体内外的稳定性显著优于脂质体[1]。PVs形成条件温和并且具有亲水性内核结构，对蛋白多肽类药物、基因药物的载药性能可望优于其他一些纳米微粒，此外通过聚合物分子的种类、分子量、嵌段比例选择，所构建PVs递药系统的理化特性乃至体内行为更具有主观的可调控性[1,2,4]。因此本研究以单甲氧基聚乙二醇－乳酸－羟基乙酸共聚物（MPEG-PLGA）和马来酰亚胺基聚乙二醇－乳酸－羟基乙酸共聚物（Maleimide-PEG-PLGA）[5]制备PVs作为载药系统，共价键连接具有靶向功能的Lf，构建一种新型的通过乳铁蛋白受体介导的脑内靶向递药系统（Lf-PVs）。 Humanin（HN）是由Hashimoto 等于2001 年成功地通过功能筛选的方法得到的一种对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD) 相关的细胞凋亡起特异阻断作用的神经保护肽，由24个氨基酸组成，是目前发现的唯一既能抑制Aβ淀粉蛋白又能抑制FAD基因突变诱发的神经毒性作用的线性短肽。HN第14位的丝氨酸替换为甘氨酸得到S14G-Humanin（S14G-HN），其神经保护作用是HN的1000倍。作为一种非常有前景的抗AD药物，S14G-HN具有高特异性以及低剂量的特点，但同时也具有难以透过BBB，易于机体内环境中代谢失活的缺点，需要脑室内注射给药，静脉给药难以达到理想的治疗效果[15,16]。结合多肽药物脑部递药存在的问题及聚合物泡囊在药物输送中的特点，本研究采用离子梯度主动载药法将S14G-HN包载于Lf-PVs内制备载药泡囊系统(S14G-HN-Lf-PVs)，考察递药系统对记忆缺陷AD模型大鼠的神经保护作用。从而对Lf-PVs作为脑部多肽药物递送系统的可行性作出评价。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 试剂：乳铁蛋白（Sigma公司）；S14G-HN肽(纯度>90%，杭州中肽生化有限公司)；淀粉样蛋白Amyloid-β 25-35（Sigma公司）；MPEG-PLGA( Mr 3000:9000，自合成)；maleimide-PEG-PLGA( Mr 3500:9000，自合成)；Sepharose CL-4B(Pharmacia公司)；山羊抗乳铁蛋白亲和纯化抗体（BioVision公司）；胶体金标记IgG抗体（10nm,Sigma公司）；2-iminothiolane（Traut’s试剂，Sigma公司）；Bax(P-19)兔多克隆抗体(Santa Cruz公司)；生物素标记二抗（Immuno Research公司）；ABC免疫组化试剂盒（Vector公司）；乙腈（TEDIA公司），其他试剂均为纯。 仪器：旋转蒸发仪（R-200，Buchi，德国）；紫外分光光度仪（UV-240 1PC，Shimadzu，日本）；粒度/zeta电位测定仪（NICOMPTM380 ZLS，NICOMP，美国）；透射电镜（CM120，Philip，荷兰）；冷冻透射电镜（JEOL 2010，JEOL，日本）；Morris 水迷宫视频分析系统（DigBehv-MM，上海吉量软件科技有限公司）；大鼠脑立体定位仪（江湾I-C型，第二军医大学）；高效液相色谱仪（LC-10A RF-10AXL，Shimadzu, 日本）；倒置相差显微镜（UFX-DX，Nikon，日本）。 动物：SD大鼠（♂，250g，中科院上海实验动物研究中心提供)。 1.2 方法 1.2.1  S14G-HN-Lf-PVs的制备及表征     制备 注入法制备PVs，将Maleimide-PEG-PLGA与MPEG-PLGA一定比例混合，溶解于有机溶剂中，将溶液缓慢注入120 mmol·L-1（NH4）2SO4溶液中[7]，静置4h，旋转挥发除去有机溶剂，Sepharose CL-4B凝胶柱置换外水相为0.01M的Nacl溶液，加入定量S14G-HN和1,4-二氧杂环己烷[6]，37℃孵育20min，透析除去有机溶剂，过凝胶柱分离游离药物得到未链接乳铁蛋白的药物泡囊（S14G-HN-PVs）。将Lf溶解，按摩尔比加入2-iminothiolane得到巯基化Lf，将巯基化后的Lf以 Maleimide:-SH=1:1加入已制备好的S14G-HN-PVs中，充氮室温下缓慢反应6h，得到S14G-HN-Lf-PVs[10,11]。 表征 泡囊粒径和zeta电位采用粒度/Zeta电位测定仪分析。1-2%（w/v，pH7.0）磷钨酸负染色后，透射电镜下观察泡囊形态。冷冻透射电镜观察泡囊的膜层结构。取500μL S14G-HN-Lf-PVs稀释液，加入山羊抗乳铁蛋白纯化抗体5μL，37℃摇床孵育1h后加入50 μL胶体金标记兔抗山羊IgG抗体，37℃摇床孵育2h，凝胶柱分离除去未结合的胶体金标记抗体，透射电镜观察[11]。 1.2.2  S14G-HN-Lf-PVs的载药量和包封率 HPLC法测定S14G-HN含量，色谱条件：色谱柱Dikma Diamonsil C18 (5 μm, 200 mm×4.6 mm)；流动相 0.07 %三氟乙酸: 乙腈（68: 32）；流速 1.0 mL/min；检测波长 210nm；进样量20µL；柱温 35℃。新鲜配制浓度范围10-1000µg·mL-1的S14G-HN去离子水溶液，制备标准曲线并且测定方法精密度。 比浊法测定泡囊溶液的浓度，紫外吸收波长350nm，通过药物浓度、聚合物泡囊的浓度以及投料量计算S14G-HN-Lf-PVs的载药量以及包封率。 1.3  S14G-HN-Lf-PVs对AD大鼠的神经保护作用 1.3.1 大鼠AD模型  Amyloid-β25-35加入注射用水溶解，配制成2 g ·L-1溶液，密封37℃振摇76 h使其成凝聚态，-20℃保存备用。SD大鼠20 %乌拉坦（800 mg ·kg-1，ip）麻醉后固定于脑立体定位仪上，头顶部去毛, 消毒皮肤, 头顶部正中切口,暴露前囟,选择双测海马为注射靶区，以前囟为原点，向后3.0mm，左右各2.0mm，7号针头钻开颅骨，沿颅骨垂直向下进针3.2mm，于两侧海马区各缓慢注入凝聚态Amyloid-β25-35 (2 g ·L-1，5L)，留针5 min后缓慢撤针，缝合切口，阴性对照组注射等量生理盐水，动物苏醒后常规饲养[17]。 1.3.2 实验分组 动物手术后随机分成9组，每组8只，与阴性对照组共10组，常规饲养14d后尾静脉注射连续给药12d，按照药物浓度，给药分组如下，阴性对照组Sham control（生理盐水，1.2mL·kg-1）；模型对照组AD control（生理盐水，1.2 mL·kg-1）；8个试验组：S14G-HN溶液组（50 μg·kg-1）；低剂量S14G-HN-PVs组（2.5 μg·kg-1）；高剂量S14G-HN-PVs组（25 μg·kg-1）；最低剂量S14G-HN-Lf-PVs组（2.5 μg·kg-1）；低剂量S14G-HN-Lf-PVs组（6.5 μg·kg-1）；中剂量S14G-HN-Lf-PVs组（12.5 μg·kg-1）；高剂量S14G-HN-Lf-PVs组（25 μg·kg-1）。 1.3.3 Morris水迷宫试验 动物给药7d后开始水迷宫行为测试。前4天为定位航行试验，记录大鼠在水池中的游泳轨迹及大鼠到达平台的潜伏期。第5天进行探索试验，记录并分析跨越平台的次数。所得数据均用Mean ± S.E.M表示，组间比较采用ANOVA，组间两两比较采用非配对双侧t检验，P < 0.05即认为存在显著性差异。所有的统计学分析采用SPVSS 11.5软件完成[15,16,17]。 1.3.4  免疫组织化学染色  水迷宫试验后处死动物，断头取脑常规石蜡包埋，于进针孔位置处连续切片，厚度5μm，Bax(P-19)免疫组化染色，3%H2O2 灭活内源性酶， 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）热修复，Bax(P-19)抗体(1∶100)稀释, 4 ℃孵育过夜，DAB显色，苏木素复染, 中性树胶封片后倒置显微镜下观察脑海马区阳性颗粒[19]。 2 结果和讨论 2.1 S14G-HN-Lf-PVs的制备及表征 2.1.1 聚合物材料的选择  两亲性嵌段共聚物可以在溶液中自组装形成具有膜层结构的泡囊，Discher等[1]研究发现，这种行为与共聚物亲脂链与亲水链的比例有关，当亲水端比例为20-40％时易形成泡囊，同时与油水相比例以及材料属性能够影响泡囊的形成。本文选择PLGA（75：25）连接亲水性PEG链合成二嵌段共聚物[2,5]，分子量比为9000：3000(MPEG-PLGA)和9000：3500（Maleimide-PEG-PLGA），所制备的聚合物泡囊内层由共聚物中疏水部分构成，表面有亲水性PEG覆盖[3]，由于PEG链的立体屏障作用，使得聚合物泡囊免受单核巨噬系统的吞噬，延长血浆半衰期。聚合物泡囊表面Maleimide-PEG需与Lf共价连接，因此在选择PEG时考虑Maleimide-PEG的分子量应大于MPEG分子量，这样使得聚合物泡囊表面的Maleimide-PEG可以伸出MPEG形成“刷状”或“雾状”结构，有利于与Lf的共价连接[11]。同时，与聚合物泡囊相结合的Lf伸出表面，有利于与BBB上的乳铁蛋白受体相结合，通过受体介导胞吞转运入脑。 2.1.2 制备方法的选择  聚合物泡囊的制备方法主要有超声法、注入法、逆相挥发法、薄膜分散法、反复过膜法等[2]。相比而言注入法十分简便，只需将溶解在有机溶剂中的载体材料注入一定比例的缓冲液或去离子水中，静置使其自组装即可，反应条件温和，对蛋白质多肽类药物具有稳定性作用[1,8]。 2.1.3 表征  通常认为粒径分布200nm以下的微粒系统脑内特异性传递效果较好[12,13]。激光散射粒径仪和透射电镜测定结果显示，聚合物泡囊连接Lf后粒径略微增加，粒子大小均匀，外观圆整，粒径126.7±20.4nm。测定Zeta电位为-2.54±0.05 mV，zeta 电位与微粒体系的稳定性、流变性以及界面和分散体系的相互作用密切相关，是粒子的滑动层与周围溶液环境的电势差，微量的负电荷使微粒不易聚集，相对比较稳定。Lf-PVs的Zeta电位主要有两部分构成[11]：粒子表面的PEG链，它能够屏蔽泡囊核心PLGA所产生的强烈负电荷，而泡囊表面Lf具有阳离子特性，因此对连接Lf后Zeta电位有略微提高。 Cry-TEM是观察聚合物泡囊结构的直接方法，结果显示Lf-PV为具有明显的外壁膜的中空泡囊结构，膜厚度约为8nm。免疫胶体金实验可以观察到有黑色的胶体金颗粒连接于泡囊外膜上，即Lf通过一抗与胶体金标记的二抗连接，说明聚合物泡囊表面连接有Lf，见图1。  图1 S14G-HN-Lf-PVs的透射电镜观察 Fig 1 Transmission electron micrograph of S14G-HN-Lf-PVs  （A TEM images;B Cryo-TEM images;C TEM images , S14G-HN-Lf-PVs labeled by colloidal gold ) bar 100nm  2.2  S14G-HN-Lf-PVs的载药量和包封率 S14G-HN肽体外分析样品在该色谱条件下保留时间约6min，峰形良好，无干扰。标准曲线方程为：y = 4831.3x + 47111 r= 0.99，浓度范围10-1000µg·mL-1。精密度实均小于5％，满足样品测定要求。比浊法测定Lf-PVs浓度后计算载药量和包封率分别为0.77%和21.78% 纳米载体包载水溶性良好的药物具有一定难度，包封率与载药方法和药物的理化性质密切相关[14]，S14G-HN结构如下：Met - Ala - Pro - Arg -Gly - PHe - Ser - Cys - Leu - Leu - Leu - Leu - Thr -Gly - Glu - Ile - Asp - Leu - Pro - Val - Lys - Arg -Arg – Ala。带一定正电荷，等电点为9.49，水中溶解度好，同时具有一定脂溶性，这就使S14G-HN在载药方面较其他亲水性强的多肽有一定优势。我们通过常规注入法包载S14G-HN，包封率很低，约5％左右，考虑到S14G-HN弱两性偏碱的性质，我们采用了（NH4）2SO4离子梯度法主动包封药物[8]，并加入了对聚合物泡囊膜具有柔性作用的1,4-二氧杂环己烷，大大提高了药物的包封效果。Choucair通过对PAA-PS泡囊内阿霉素的释放研究[7]，认为1,4-二氧杂环己烷是泡囊膜层PS的增塑剂，可降低PS的粘度，使膜层渗透性增加从而有利于药物的透膜。 2.3 S14G-HN-Lf-PVs的大鼠药效学 2.3.1 AD模型的建立 AD的神经病理学特征是老年斑、神经原纤维缠结、淀粉样血管病变以及突触和神经元的丢失，1994年Atsumi等提出β-淀粉样蛋白脑内注射的大鼠可被用于AD的动物模型，β-淀粉样蛋白在脑内沉积与乙酰胆碱神经元变性和学习记忆损害相关,可以用来研究治疗AD的药物在β-淀粉样蛋白集聚或沉积、代谢、神经毒性作用。实验显示，β-淀粉样蛋白的毒性片段Amyloid-β25-35对原代培养的海马神经细胞具有神经毒作用，直接注射入大鼠海马可造成AD的特征性病理变化，可较好的模拟AD行为学和病理表现，因此我们采用Amyloid-β25-35大鼠海马注射来制备AD模型[16]。 2.3.2  Morris水迷宫试验  Morris水迷宫作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具[16,17]，检测大鼠在训练中形成稳定的空间位置认知，这种空间认知是加工空间信息形成的，所形成的记忆是一种空间参考记忆。从信息的加工和提取方式来看，这种空间参考记忆进入意识系统，其储存的机制主要涉及边缘系统如海马以及大脑皮层有关脑区。而临床健忘和痴呆的病人，正是陈述性记忆首先受损而且比较突出。所以从检测的记忆属性来说，运用Morris水迷宫来进行防治此类疾病有效药物的筛选研究是比较恰当的。 由实验结果可知，随训练天数增加，阴性对照组大鼠潜伏期明显缩短，而模型对照组大鼠未出现明显潜伏期缩短趋势，训练期间的潜伏期较假手术组长，两者存在显著性差异，说明采用Amyloid-β25-35大鼠海马注射建立大鼠AD模型方法可行。25μg·kg-1 S14G-HN溶液静脉注射对Amyloid-β25-35所致空间记忆障碍无改善作用，仅到第四天潜伏期才有一定的缩短，但与模型组无显著性差异，空白Lf-PVs同样对对Amyloid-β25-35所致AD记忆障碍无改善作用，大鼠上台的潜伏期并不随训练天数的延长而缩短。S14G-HN-Lf-PVs组第二天开始与AD对照组具有显著差异（P<0.05），第四天具有极显著差异（P<0.01）。第5天的探索实验结果显示，AD对照组大鼠跨越平台的次数显著低于假手术组。空白Lf-PVs、S14G-HN 溶液（25μg·kg-1）、S14G-HN-PVs（2.5μg·kg-1），大鼠跨越平台的次数与模型组无显著差异。S14G-HN-Lf-PVs（25μg·kg-1）、S14G-HN-Lf-PVs（12.5μg·kg-1）大鼠跨越平台的次数均显著高于模型组（P<0.01）。S14G-HN-Lf-PVs组 （6.25μg·kg-1）具有一定差异但并不明显（P<0.05）。高低剂量组之间存在量效关系，但是S14G-HN-Lf-PVs的25μg·kg-1与12.5μg·kg-1两个剂量组无极显著差异。结果表明S14G-HN-Lf-PVs对Amyloid-β25-35诱导的AD大鼠学习记忆障碍具有明显的改善作用。见图2，图3。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 图2 S14G-HN-Lf-PVs对Amyloid-β25-35脑内注射诱导的大鼠行为记忆缺陷的药效试验结果。 Fig 2 Neuroprotection effects of S14G-HN-Lf-PVs on the impairment of rats with learning and memory deficits induced by Amyloid-β25-35 in the Morris water trials (i.v n=8). (Sham control , given saline instead of Amyloid-β25-35;AD control , daily applied saline; Blank Lf-PVs, administration of blank Lf-PVs ; S14G-HN-Lf-PVs, administration of S14G-NH loaded Lf-PVs at the dose of S14G-NH 25μg·kg-1; S14G-NH-PVs ,administration of S14G-NH loaded PVs at the dose of 25μg·kg-1 VIP S14G-NH ; S14G-NH solution , administration of S14G-NH solution at the dose of 25μg·kg-1. P<0.05, significantly different from sham control; ▽P<0.05, significantly different from AD control.) 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 图3 S14G-HN-Lf-PVs对Amyloid-β25-35脑内注射诱导的大鼠行为记忆缺陷的药效试验结果。 Fig 3 Neuroprotection effects of S14G-HN-Lf-PVs on the impairment of rats with learning and memory deficits induced by Amyloid-β25-35 in the Morris water trials (i.v n=8). (Sham control , given saline instead of Amyloid-β25-35;AD control , daily applied saline; Blank Lf-PVs, administration of blank Lf-PVs ; S14G-HN-Lf-PVs, administration of S14G-NH loaded Lf-PVs at the dose of S14G-NH 25μg·kg-1; S14G-HN-Lf-PVs(25,12.5,6.5,2.5) administration of S14G-NH loaded Lf-PVs at the dose of S14G-NH 25,12.5,6.5,2.5 μg·kg-1;S14G-NH-PVs(25,2.5) ,administration of S14G-NH loaded PVs at the dose of 25,2.5 μg·kg-1 VIP S14G-NH ; S14G-NH solution , administration of S14G-NH solution at the dose of 25μg·kg-1. P<0.05, significantly different from sham control; ▽P<0.05, significantly different from AD control.) 2.3.3 免疫组织化学染色  从免疫组化染色结果可知阴性对照组大鼠脑内Bax 蛋白有极少量表达，而AD对照组大鼠海马、内嗅皮层等部位Bax 蛋白阳性细胞明显增多，S14G-HN-Lf-PVs组大鼠同样出现Bax 蛋白阳性表达，但是相对AD对照组阳性细胞数明显减少，图4。 Bax蛋白是一种促凋亡蛋白，在Aβ蛋白序列中Amyloid-β25-35的神经毒性较强，有研究发现大鼠杏仁核注射Amyloid-β25-35后细胞凋亡相关蛋白Bax 表达上调，从而引发神经元细胞的凋亡，出现AD相关的病理改变[18,19]。而S14G-HN对依赖于Bax的细胞凋亡具有有效的抑制作用。实验结果说明S14G-HN被包载于聚合物泡囊中，通过乳铁蛋白受体的介导起到了主动靶向于脑部的作用，抑制Bax蛋白过量表达从而对神经细胞起到保护作用。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 图4  免疫组织化学染色 Fig 4 immunohistochemistry staining (A Sham control; B AD control; C S14G-HN-Lf-PVs) 3 小结 本研究以两亲性嵌段共聚物MPEG-PLGA、Maleimide-PEG-PLGA为载体材料制备聚合物泡囊递药系统，并且通过共价键结合将乳铁蛋白连接于泡囊的表面起到功能性靶向头基的作用。通过主动载药法将短肽S14G-HN包载于泡囊内，显著提高了包封效率。S14G-HN-Lf-PVs的药效学试验表明，与未修饰蛋白的PVs组相比，Lf-PVs组可以明显的改善AD大鼠模型的认知障碍同时抑制了凋亡蛋白Bax的过量表达，起到神经保护作用。说明我们制备的载药系统具有较好的脑内主动靶向递药效果。作为一个新的研究热点，聚合物泡囊作为载体的微粒递药系统近期内逐渐得到开展，特别是在针对肿瘤、神经退行性疾病的治疗，我们将在后续工作中继续作出探讨。 Acknowledgements 感谢国家自然科学基金30762544和中国博士后基金20060390144对本课题的资助。 REFERENCES [1] Discher DE and Eisenberg A. Polymer vesicles [J]. Science, 2002, 297: 967-973 [2] Discher BM, Won YY, Ege DS, et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers[J]. Science, 1999, 284: 1143-1146. [3] Photos PJ, Bacakova L, Discher B et al. Polymer vesicles in vivo: correlations with PEG molecular weight. [J]. J Control Release, 2003, 90(7): 323-334. [4] Bermudez H, Brannan AK, Hammer DA et al. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability [J]. Macromolecules, 2002, 35(21): 8203-8208. [5] Ahmed F, Discher DE. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis triggered controlled release vesicles [J]. J Control Release, 2004, 96(1): 37-53. [6] Wu J, Eisenberg A. Proton diffusion across membranes of vesicles of poly(styrene-b-acrylic Acid) diblock copolymers[J]. J AM CHEM SOC, 2006, 128(9): 2880-2884. [7] Choucair A, Soo PL, Eisenberg A. Active loading and tunable release of doxorubicin from block copolymer vesicles [J]. Langmuir 2005, 21(3): 9308-9313. [8] Arifin DR., Palmer AF. Polymersome encapsulated hemoglobin: a Novel type of oxygen carrier[J]. Biomacromolecules, 2005, 6: 2172-2181 [9] Bin J, Jun M, Makoto H et al. Pharmacokinetics and brain uptake of lactoferrin in rats[J]. Life Sciences 2006,78:851 – 855 [10] Olivier JC, Huertas R, Lee HJ et al. Synthesis of pegylated immunonanoparticles[J]. Pharm Res 2002, 19(8): 1137-1143. [11] Huwyler J, Wu DF, Pardridge WM. Brain drµg delivery of small molecules usiμg immunoliposomes[J]. Proc Natl Acad  Sci，1996, 24 (93):14164-14169. [12] Pieter JG, et al. Targeted delivery across the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Delivery, 2005, 2(2) : 299－309 [13] Quentin RS. Carrier-mediated transport to enhance drug delivery to brain[J]. International Congress Series. 2005, 1277:63–74 [14] Bickel U, Yoshikawa T, Pardridge WM. Delivery of peptides and proteins through the blood-brain barrie r[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2001, 46 (1-3): 247-279. [15] Takayoshi Mamiya , Makoto Ukai. [Gly14]-Humanin improved the learning and memory impairment induced by scopolamine in vivo. [J]. British Journal of Pharmacology 2001,134:1597 - 1599 [16] Tajima H, Kawasumi M, Chiba T et al. A humanin derivative, S14G-HN, prevents amyloid--induced memory impairment in mice[J]. Journal of Neuroscience Research 2005,79:714–723 [17] Xiao ling G , Bing xian W, Xin guo J et al.Brain delivery of vasoactive intestinal peptide enhanced with the nanoparticles conjugated with wheat germ agglutinin following intranasal administration[J]. J Control Release, 2007,6(12):1156–167 [18] Su J.H, Deng G,Cotman CW. Bax protein expression is increased in Alzheimer's brain : Correlations with DNA damage, Bcl-2 expression, and brain pathology[J]. Journal of neuropathology and experimental neurology 1997,  56, (1): 86-93  [19] M Yu. Stepanichev NA, Lazareva, MV et al. Effects of doses of fragment (25–35) of β-amyloid peptide on behavior in rats[J]. Neuroscience and Behavioral Physiology 1998,28(5):597-600 图1 图2 图3 图4 [19] M Yu. Stepanichev NA, Lazareva, MV et al. Effects of doses of fragment (25–35) of β-amyloid peptide on behavior in rats[J]. Neuroscience and Behavioral Physiology 1998,28(5):597-600 图1 图2 图3 图4