猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性抗原表位重组腺病毒的构建及鉴定

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性抗原表位重组腺病毒的构建及鉴定 猪圆环病毒型 蛋白特异性抗原表位重组腺病毒的构建及鉴定 ,,,, ，，,,,,, ,,,,,,，，，，，，，河南农业大学 牧医工程学院河郭 全 海陈 陆王 川 庆吴 德 峰王 永 生李 志 娟王 艳 ,, ,，,，,南 郑州 商丘职业技术学院河南 商丘 福建农林大学褔建 福州 ,,:::,,,,,,:::,,,,:::, ,，摘要猪 圆 环 病 毒 型 基 因 表 达 的 蛋白含有病毒的主要抗原表位 是 基因工程苗研究的主 , ,:,,:,,,:,,:,,, 要 候 选 蛋 白 。 根 据 公 布 的 基 因 序 列 设 计 对 引 物 ，从 感 染 有 的 细 胞 中 扩 增 ,;,,,,，,:,,, ,:, ,:,, ,，,, ,出 。 ，包 含 个特异性表位的 蛋 白 基 因 片 段 把 蛋白基因目的基因克隆入腺病毒 型 穿 梭 质 粒 中 构 成 重 组 , :,,:,,, 穿 。 梭 质 粒 分 步 把 骨 架 质 粒 和重组穿梭质粒 分别用化学方法 ,,～～,,,;,:,,,,,,, ,,;,,,, ,,～～,,,;,:,,,,,, ,,!, ，，。 转 化 入 感受态工程菌中 同源重组后的质粒转染 细 胞 在细胞中包装出重组腺病毒 通 过,，,,,, ，，，,,,, , 、、。 免 疫 荧 光 及 检 测 证 明 基 因 在 中 获 得 了 表 达 为 的 快 速 检 测 ,:,，,,,，，，,, ,:,,:,,,，，，,,,, ,:,,, 方 ,,,,,,,。中图分类号文献标志码文章编号法 检 测 试 纸 条 的建立及腺病毒活载体基因工程苗的研究奠定基础 ,,,,,,,,,::,,,,,,:,,:,,:,,:, ,,, ,,,,,,,,关键词猪 圆 环 病 毒 型 蛋 白 基 因 基 因 腺 病 毒 鉴 定, ,:,,:,:,,,, ,:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,:, :, ,,,:,,,,,,, ,,,,:,,,,,,, ,:,,,,,,,,,, , :,,,,,,,:,,:,,,,,,,,,:,,,,,, ，，,,,,, ,,,，，，，，,,: ,～,,～,,:，，， ，～,,，, :～～,,,, ,;,;,,,，, ,:,,～;,，，,～,,,,,,,,,,,,, ,, ，,，～,,,,，, ,,,,,,:,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, , , ，，,，，,,,,,,,,,:,,,,,:,,,:::,,,,,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,,, ,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,, ，,，，,,,,,,,,,:::,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,:::,,,,,,,,,, ,，,,,,,,,,，,,;,,,,,:,;,,::,,,,,,:,;,,,,,,,;:,;,,:;,:,:,:,,;:,,::,,,～,,;,:,;,;,;,～,:～,,,;,,,,,,,,,!,,, ，,,:～;,;,,,,;,,:,;,;,,:;,,,;;,,,,,::,,;,,,:::,,,,,:,;,,,,，,;,,,;,,,,,:,,,,;,,,～,:～:,,,,,,,!,,,,,,,,! :,,:,;,,;,;::,,,,,;,,,:,;:,,,:;,,:;,,,:, ,，,,,,,;:,;,,:,,,,:,,,～;;,;,,,,～,:,:,;,,,,:,,,,,,,!, ,～;,～～,,,;,;:,:,,～～,,,;:,, :,,,;,:,,,～,;,,;,:,;,::,,,,～:,;,,;::,,,,,,,,～～,,,;,,,,,,,,～～,,,;,,!,,,, :,,,,,,,,:，,:,;,;:,:,,,;,,, ,,,,,～～,,,;:,,,,,,,,,,,:,,;,,,,:::,;,;,,,，,,,, ,:～;,,:,,,,!,,,,,! ，，,;,～:,,,,,;,;,,,,～;,;,;～:,:,::～,,;::,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,:,～:;,,;::,,,,,,,:,,,;,:,,,～,;,,,,;,,～;!!,,! 、、,,,,,:,,;,,,,: ，，，,,,,:;,,,，,,;,,,:,:,:,,,;,;,:,;,,,,,,,，，，,,,,:;,,,;,;:,;,,,:,，,,,,,,,,! ,,,,,～,:,,～:,;,:;,,,,,,,,，，，,,,,～;,,～,,,,,,～;,:～,,,,,:,,:,,,,,,;,;:,,:, ,;,～:, ,;,;:,,:,,,,,,:，!!,, ,,,,;,;,:,;,,:,,～;,;::,,,,,,,,,;,:,,,～,;,,,::,,;,,,,,,,:,,,,, ,,,,,,,,,:,,,,:,:,,;:,,::,,,～,,;,:,;,:,,:,;,,;,;:,,,;,;,;::,,,,,,,,,;,:,,,～,;,，,;,,,,,:,,,:,,!,,,,, ,:,,,,:,,,,,,,,:, , ,, ,,,，,，,猪 圆 环 病 毒 是 圆 环目前的 研 究 认 为 对 猪 没 有 致 病 性,:,:,,;:,,::,,,～,,:,,:,, ,,,，。病毒科圆 环 病 毒 属无囊膜的单股 环 状 的 病对猪有致病性但两者都不引起细胞病变,，, ,:,, ,,, ，。 毒是迄今为止发现的最小的动物病毒之一根据,常与断奶仔 猪多系统衰竭综合症,:,,,:,,,, 、的致病性抗原性和核苷酸的序列差异将它分 ，,、,:, ;,,,,,～,,,,,,;,,: ,,,,,,,,,,:,;,,,,, !,! ,,,。为 和 个血清型,,、,,猪细小病 毒 病 间 质 性 坏 死 性 肺 炎 ,:,,,:,,, ,,,,，,, ,,, ，。等疾 病 混 合 感 染结 果 导 致 猪 免 疫 失 败,,,, ，，，年在加拿大首次暴发此后在世界许多国,,,,收稿日期, ,:,:,:,,:, ,,, ,,,,。基金项目国家高技术研究与发展计划项目河家和地区相继有该病发生报道临床多以渐进性,::,,,,::,:, ,,南省高等学校青年骨干教师计划资助项目,:,:,,，,,:,, ，消瘦及多系统病理变化为特征已经给全球的养猪 ,,,，，。作者简介郭全海男硕士,,,:, 。业造 成 了 巨 大 的 经 济 损 失基 因 全 长 为,:,, 通讯作者 , ，,利用中设计的引或有个主要的开放阅读框引 物 特 异 性 鉴 定 ,,,, ,,,,,,:;,,,,,, ,,,,, ,, ，,,。，和 物的 及 全基因组质粒分别作模,:,,,，, ,:,,,;,,,,,,,,;,:,,:,,, :,,,:,,, , ，主板进行 扩增产物用的琼脂糖凝胶电泳检,:, ,, , 要编码与病毒复制相关的 蛋白主 要 编。测,;:,,, , ，， 码病毒 的 结 构 蛋 白即 蛋 白构 成 病 毒 的 核 衣把骨架质粒腺 病 毒 同 源 重 组 质 粒 的 构 建 :,, ,,,,, ，，壳是刺激动物机体产生抗体的重要蛋白具有很好，转化到 工程菌种方法参照文献,,，,,,,,,;,,,,! ，，的免疫原性而且 上有个抗原位点其中:,,, , , ,,。进行制备细菌液均匀涂抹在含有氨苄青霉素,, 个抗原表位 表 达 的 蛋 白 与 血 清 型 无 交 叉 反 ,:,, ,,,,，。，的 平板上培养挑取菌落用碱裂解,,，, ,,?,,～ 。应等研 究 证 实 编 码 蛋 ,,～:,,:,, :,,, , ，、法抽提质粒用 酶 进 行 酶 切 电 泳白的个特异性抗原表位分别位于其所编码的 ,,,，，::,, ,, ?? ，。 ，处因此蛋白是考虑疫 ,,,,,,,,,,,,:,::, ，,鉴定含 有 质 粒 的 菌 命 名 为 ,,;,,, ,，,,,,,!,, 。 苗制备的主要靶抗 原 蛋 白本 研 究 构 建 了 含 有 。菌将 扩 增 产 物 及 ,:,, :,,, ,:, ,～～,,,;,，蛋白特 异 性 抗 原 表 位 的 重 组 腺 病 毒并 ,:,,:,,, 。获得到了良好表达 ，穿梭质粒分别用 及 双酶切分:,, ，,，,,, ,?? ，别进行胶回收，纯化目的基因片，段并按一定的比例。混匀加 入 连 接 试 剂在 连 接 槽 中 连 接 ,,? ,,～ 材料与方法, ，感受态细胞然后涂于含卡那连接液转化 ,，,α 霉材料 ,,, ，，素的 平板上培养挑取白色菌落进行，, ,,?,,～ 、、穿梭质粒 质 粒 菌 株 病 毒 及 细 胞 ,～～,,,,,,,, 。增菌培养菌液送上海生物工程技术服务有限公司、骨架质粒 及 工程菌由,,;:,,,,;,,, ,，,,,, ,,,! ，，进行测序并提取质粒作模板进行 鉴 定阳 性 ,:, ,,,、兰州兽医研究所 惠 赠病 毒 株,:,, ，, ,:,, 。 质粒命名为用 酶切该 ,,～～,,,;:,,,,,,,;,,,? ,全 基 因 组 构建的 质粒均由本实验 室 保 存，，，，，,重组 质 粒使 其 线 性 化 后 去 磷 酸 化化 学 转 化 入 ,,细胞 购 自 中 国 武 汉典 型 培 养 物 保 藏 中 心,感受态 菌 中 与 骨 架 质 粒 发 生 ,,,, ,，,,,,,,;,,, ,,!, 。同源重组用 碱裂解法抽提质粒进行酶切和 ,:, ,,。::,:: ，，鉴定阳性质粒命名为并通过化学方法 ,,,,,,,,聚 合 酶 及 主 要 试 剂 ,,,,，, ,，,,,,,,, ，。转化入 感受态细胞中冻存于备用 ,，,,,:?α,,,等购于宝生物工 程 大 连有 限 公 司,,,，;,,,:? 重组腺 病 毒的包装及噬斑纯化 含 有 :,,,,,, , 酶和 酶 购 于 公 司,,;，，, ，,:,;:,,,,,;,:::? , 基因的重组腺病毒质粒用去内毒素抽提试剂盒抽提。购自公司,,,,,,,:;,, ，，纯化经 酶切线性化后用无水乙醇沉淀灭菌 ,,:? 方法,,, ，双蒸水溶解后采用脂质体转染法转染 ，，，,,,, ,的 提 取 病毒的增殖参,,,,, ,:,,,，, ,:,, ，，，细胞培养待细胞出现明显病变后收 ,,::,,,? ,,，,,。照文献进行的提取方法参照文献进集重组腺病毒并通过噬斑纯化 ,,，, ,: 。行 重组腺病毒及表达产物的鉴定 ,,,蛋 白 基 因 片 段 的 扩 依 据 ,:,, :,,,,,,, 重 组 腺 病 毒 的 鉴 定增重组腺病毒质粒,,,,, ,:, 公布的 序列设计能扩增 ,;,,,,，，,,,::,,,:,, ，扩增 片 段收 集 病 变 的 ,，,:, :,,, ，，，,,,, 上含有个特异性抗原表位,:,,,,,,,,,,,,,: 细,。 ,的 引 物上 游 引 物 ,,,,,,,,,,,,′:, ，，。 胞反复冻融次提取 鉴定鉴 定将重组腺病 毒 接 种 到 长 满 单,,，,,:, ,,,,, ，,,, ,,:, ，，层的 细 胞 孔 板 上培 养 ,，，，,,,, , ,,～,,,下 游 ,::,,,:,,,:,,,::,:,,,:,′, ,引 物 ，，洗涤 次每 次 的 戊 二 醛 固 定 , , ,,,:,,,, ,,,,,:::,,,:,,,,,,:,,,,,,,,,′, : ,,,, ，，，洗涤次弃净洗液加入倍,,,,,,, ,,,: ?,，，测试剂盒中产 品孵 育 洗 涤 ,。 扩增片段长度为 在上下游引物,,? ,～,,,, , ,,,,,,′,, ，次稀释, 每次加入倍稀释的兔抗猪 中分, ,,,,,::，, ?, ,的猪抗 阳性血清科前公司 检酶标,:,,,:,,，，，,, 。别加入了 和 酶 切 位 点扩 增 ，, ，,,, ,:, ,? ? ，，，,二抗温育洗涤次每次加,,,?,～,,,, ,,,,,,,体系 ,,，: ,,,,，,:×,～,,;,,,:，,,,μμ ,入底物 天 根 公 司 底 物 显 色 试 剂 盒 产，,,,,, ,:, , ,，。 品显色显微镜下观察结果鉴 定将重组腺病毒接种到长满单层,,,,,,,,,,,, ，,, ,, ,,:,，,,:，,，,, ,:,,:,，,,: μμ ，，，。的 细胞孔板上培 养 弃 去 营 养明目的片段成功克隆到穿梭质粒上，，，,,,, , ,,～, ，,,，液用丙酮乙醇室温固定 ,,, ,,,,?? 洗,,, ，涤次加入倍稀释的猪抗 阳性,,,: ,:,, ? 血清 ,,，，对照组加阴性血清孵育洗涤,,?,: ,,,,,,, ，次加 入 倍 稀释 的荧光素标记兔 ,,,::: ? 抗 猪间 接 鉴 定接 种 重 组 腺 病 毒 的,,,,, ，，，,, ，。 酶标二抗避光孵育 荧光显微，细胞 病 变 后 回 收去 除 细 胞 碎 片 纯 化，, ,,? ,: ,,,,，，，,,,, , ，,，镜后检测蛋白 含 量 为 作 ,,,,,，,?,,:: , 。倍下 观稀察结果 ，释同时设定正常 细胞培养纯化物作对，，，,,,, , ，，，，照每孔 包 被 过 夜,::，,,? ,～,? ,,,, 图重 组 穿 梭 质 粒 鉴 定 μ,,,～～,,,;:,,,,, ,,,,:, ,,,, 洗,重 组 穿 梭 质 粒 ，,,,;,,,,，;,,,,,～～,,,;:,,,,,,,, ,，,,涤拍干后用明胶封闭洗涤的 鉴定基 因 的 扩 增重,:, ,,,:,, :,,, ,:, ,,,,,, ,～,,,, , 组穿梭质 粒 和 酶 ,,,～～,,,;:,,,,, ，,，,,,次,,,,? ? 切鉴定,空白对照,, 每孔 加 入 猪 抗 阳 性 ,:: ，,,:: ,:,, ?μ ，血 清 重组腺病毒质粒的鉴定 线性化的 ,,,,,,,,:,, ，,孵育洗涤次每孔加入兔,,?,～,,,:::? ,质粒转 化 感 受 态 菌,,～～,,,;:,,,,, ,，,,,,,,,, 抗猪 结果，，后抽提 质 粒 经 酶 切 后出 现 明 显 的 条 带,,:, ,? ，，， 酶标二 抗孵 育 洗 涤 次每 孔 加 入 底 物,,? ,～, ,,，图以 重 组 质 粒作 模 板 进 行 电,,,,,,,, ,:, ,,, ，显色系统显色加入,,, ,::，,,? ,, ,,,蛋 白 基μ 因 的 扩 增 及 引 物 特 性 鉴 定 ,,, ,,,,,,, ，，泳鉴定扩增出目的片段证明种质粒发生了同源, , 以 做模板扩增的 产物经凝胶电,:,,,，, ,:, ，。重组片段插入到腺病毒骨架上,:,,:,,, ,，，值计算阳终止液测定 ,:,， ，,:,:， ,,,,,:μ，，泳鉴定扩增出与预期相符的目的片段而以 ,:,, 性 ,,，全基因组质粒 做 模 板 为 扩 增 出 片 段 图 表 明 所, ,，。孔 对照孔 重复次,,,,,:,,: 。设计引物是针对 的特异性引物,:,,:,,, ,重组腺病毒质粒 的 鉴 定图,,,,,,, ,,,,,，,,, λ? ,,重 组 质 粒,,,，;,,,,,,: ,，,,,;, ,,,，;,,,, 图蛋 白 基 因 的 扩增及引物特性鉴定 ,:,,:, ,, , ,,的 酶 切 鉴 定重 组 质 粒 ,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,? , ,,蛋白基因的 扩增,，,::: ,,,，;,,,,:,,:,,:, , ,酶切骨架质粒 空白对照,,,,:,,;,,,,,? ,!, 蛋白基因的 扩增,,,:,,:,,:, , 重组腺病毒质粒转染 细胞线性,,,,,,,,,, , 重 组 穿 梭 质 粒 的 鉴 定 ,,,,,,,,,,,,:, ,,,,,, 化的质 粒 脂 质 体 转 染 细 胞,,,,,,, ，，，,,,, ,, 重组穿梭质粒测序结果与预期,,～～,,,;:,,,,,,,, ，，后第天开始出现病变第天大部分细胞萎缩聚,, ，。的相符扩增出了预期片段及 ,:, ，,，,,,,?? ,,，,,。集成团状图正常的细胞图则生长良好,, ，,,。 双酶切重组 质 粒出现了预期结果图 结 果 表, 讨论, ，，研究发现对养猪业的危害越来越严重,:,, 。，已经是猪生产业非常重要的传染病之一目前该病 ，的诊断多用 及 等方法但这些方法较费 ,:, ，，，,, ，，时费力急需要一种高灵敏度的快速检测方法如试 。， 纸条检测方法一些研究证实蛋白具有很好的 :,,,,,, 。免疫原 性等证 明 用 杆 状 病 毒 表 达 的 ,,,,:～,,, ,, ,图细胞病变细胞正常细。蛋白可诱导猪产生较好的免疫应答, ，，，,,,, ,,,,,:×,:,，,,,,,～,, ,,,,胞，等用表达 蛋白的质粒免疫小鼠该蛋白可以 :, , 。 诱导小鼠产生一定的抗体 水 平国 内 的 王 先 炜 重组腺病毒的 鉴定及表达产物的鉴定 ,,, ,,, ,,,,,,,,，，等欧阳素贞等利用腺病毒载体也表达了 :,, 鉴 定重组腺病毒质粒及噬斑纯化的,,,,, ,:, 。，蛋白并做了相关研究这些研究表明基因蛋白 :,,重组腺病毒 后均扩增出了 蛋白目的基因,:, :,, 。是疫苗研制及相关研究的首选在前人研究的基础 ,,。，。片段图结果表明成功获得了重组腺病毒, ，上本研究借助于腺病毒表达载体构建了含有 ,:,, 。蛋白基因上个特异性抗原表位的重组腺病毒:,,, 试验中利用两步化学转化的方法在 工,，,,,, 程菌中构建 了 携 带 目 的 基 因 片 段 的 重 组 腺 病 毒 质 。，粒首先把骨 架 质 粒 化学方法转化到 ,,;,,, ,!, ，，工程菌感受态中然后将其制备成感受态细胞再把 线性化的重组穿梭质粒转化到 ,,～～,,,;:,,,,,,,, ，。其中使骨架 质粒和穿梭质粒发生 同 源 重 组种 , ，质粒分步转化可以提高成功率这可能是 种质粒 , 。 同时转化入感受态 中较难的原因线性化 ,，,,,, ，，的重组穿梭质粒进行了去磷酸化避免了自连也可 。，，以提高转化率该方法简便快捷易于操作省去昂 ，，贵仪器普通实验室均可以进行为国内相关实验室 。从事相关试验提供了一个很好的参考方法骨架质 图 重 组 质 粒 及 重 组 病 毒 鉴 定,,,,,,,, ,:, ,, , ，粒和穿梭质粒间存在 种同源重组方式一种是 , , ,,重组质粒鉴定,，,::: ,,,，;,,,,,,,,,,,:, ,,, ,种质粒的左臂与右臂之间的重组另一种是发生在,重组 腺 病 毒 感 染 细 胞 鉴 定，，，,,,, ,:, ,,, 。 ，两者 的 与 右 臂 同 源 序 列 间本 试 验 中出 现 的 :,,细胞 鉴定，，，,,,,, ,:, ，是第一种重组方式酶酶切产生条,,:,,,::,?, 。的条带试 验 中 所 用 腺 病 毒 载 体 表 达 系 统 为 缺 失 鉴 定接 种 腺 病 毒 的 病 变 ,,,,, ，,,, ，，，, ，和 基因的人型腺病毒基因与腺病毒复 ，,，,,，, ，细胞 提取后 鉴定能扩增出 ，，，,,,, ,，, ,:, :,,,制相关细胞能够提供该基因因此重 ，，，,,,, ,。组腺病毒能够在该基因中复制增殖 ，目的片段大小一致的片段而正常的 中，，，,,,, , ，，本研究 利 用 及 方 法 ,:,，,,,，,, ，，，,, 。 ，。则不能结 果 表 明目 的 片 段 成 功 插 入 腺 病 毒 中证明了 基 因 片 段 在 细 ,:,, :,,, ，，，,,,, ,，试验接种腺病毒的 细胞呈现褐 ，,,, ，，，,,,, ,胞 ，中获得了稳定表达为单克隆抗体的制备及进 一步 ，。 ，红色而 未 感 染 对 照 组 细 胞 则 不 是结 果 表 明 ，组装 快速检测试纸条奠定了基础也为基因 ,:,,。基因在细胞中获得了表达:,,, 。工程苗的研制提供了良好的物质基础 鉴 定，免疫荧光试验中加 阳,,,,, ，,, ,:,, ，性血清的细胞荧光显微镜下呈现荧光对照组则看 ，，。不到证明基因在细胞中被表达:,,, 间 接 结 果 次 间 接 检 测,,,,, ，，，,, , ，，，,, ,孔 值 与 阴 性 孔 值 平 均 比 值 结 果 分 别 为,, ,,:,,: ，，，，，，均大于 证 明,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,, ,参考文献。基因在 细胞中获得了表达:,,,，，，,,,, , ，，，,,,,;:～,,,,:，;,,,,,:,,,;,,,,:～,,,:,;,,,,,,:,! ,,下转页,,,: ,,，，,,,,;:,;,,,,,,,,,，,，,;, ,,,:,,::,,,,,,,,,:,～～,,,,,,,,,,;,;,,,,,,,;,,,,,:,,,:,:,,,:,,,, ,,，，,,,,,,;,,,,,;,,,;,:,:～，,，,;, ,,,:,,::,,,,,, ,, ，，，,:,,,,,, ,，;,,;,,,:，;,,,,;,,,,，,;,,,;,,!!,, ,,,,,,,,,, ,,,;,:,～:,,:,:,,,,,,,,,,;,,;,,,,;,,～,::,,,,,!, ，，，,,,,:，;:,,， ，,;,,～, ,，,,,～,, ,;,,,,,:,;:～, ;:,,:,:,,, ,,,～:,:,,;:,,::,,,～,,,,:,:,,; ,,,,,,,,,，，,,,，,:,,,～,，,，::,,,,～:,,,,,,,,,,,,,,, ,,,:～,,,:,;,,,,,,:,:,:,:,,;,,,,,～,,,:,～,,,,,,, ,, ，，，,,，,,，:,，,,，,,,,，,,;;～,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,, ，,,,～,,,,,,,:,,,,,,,,;,;,,::～,,,,;,，,,;,,,:,:,,, ,,,,:,;:, ,,,,;，,;,,,;,,,, ,;,:,～:,,:, :, !,,，，,,,:,,::,,:,,,,,,,,, ,:,,,;,,,,,～,,,,,,;,,: ,,,,,,,,,,:,; ,, , !, !,,:,:,,:,,:,,,,;,::,,,;:,,:,,,,～,:,:,,;:,,::!, ,, ，，，,,,,,,，,;,;,,,;,:,,,,:,:;,,,,,,,,;,,:,,,éé,,, ,,～,;,,,;～,～,,;,,,;,,,,,,,,;～;,,,,,,,,,:;，,,!, ，，,，,;,,,,:,,::,,,,,,,,,,, ,, ，，，,,，，,,,～,,,,,,:,:,,;,,,,:,,,～,，,,;,,,,～:,,:::,，;,,, ,，,，;,，::～,,,;,, , ，;,,,,，,,:,;,!, ,,,,,,,,,,,,,,;,;:,,:,,,,;,,,:,,,,,,～,,;,;,,～,～,;,,,;,:;,!,, ，，，，,,,,,,,:,,,, ,,,,,,:～ ,,;,,,，;,,,,，,;,,,;,,,,é,,～～,,,,,:,～～,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,, ，，,，,;,,,,:,,,,,,:,,,,,,,:,，,::～,,,,:,:,::,,;,,,:,,,,,,,,,～,:,:,,;,;,:,,,, ,, ，，,，;，,,,,,;,,,,,,,, ,,;,,é,，,,,;,,,;,:;:,,,,,;,～:,,,;,,,,;,,,,,:,,,,,:,;,,,～,,,,,:,:,,;,,!! ,,，，,,,:,,::,,,～,,，,，,,,:,,::,,,,,,,,,,,,,,,:,～; ,;,: ,,,～, ,, :,,,;,,,,,～,,,,,,;,, ,,,, ! : ,,,,,,,,,,,,:,;,,,,,,,;:,;,,,,,:,,,,,,!,,, ,,上接页,,:, :,,,,:,:,:,,,,:,;,,,,:,,;,,,,,;,:,:,,:,;,:,,::,,,～,,，,,,,,::,,,;,,,,～,,,,,,,,,,,,!,!,,,! ,,，，,:,,;:,,::,,,～,;,,,,,,;,,,,,:,,,:,:,,,,～,:,;,;,,,,,,:,;,,,,,，,，,;,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,，，,,,;,,:;,，,，,;,,,,:,,:::,, ,,,,,,,,,, ,,～,,,,, ，，，,,,,,,, ,,;;～,,,,,:,,;,,,,，:,;,:,:,,;:,,,, ，，:,:;,,,,，,;,,,,,:,,,:,:,,,,,,～,:,;,;,,,, :,,,,,,,,::,,,～,,,:,,,,,,～,,,,,,,,,;,,;,,,,:,;,，,,,,! ,;,,:;,,:, :,:,,; :,,::,,,～,,;,,,,,;, :,:,,,,!,,，，,:,,,,,，;,,:,;,;,,,;,,,,,,,,,,～,,,,,,;:,,:,, ,;,,;:,,,,,,,,,,,,,,, ,,，，,,,,, ，，，，,,,:～,,,:,,::,,,,,,,,,,,,,,, ,，,,,,，，,,，,,，,,，,,,,:,; ,;,,,,,;,:,～:,,:,:,, ,;,,:,,:, :,,,;,,,,,～,,,,,,;,,: ,,,,,,,,,,, !, !, 陈，，，,,,,，,,陆杨 霞王 江 辉等猪 圆 环 病 毒 型河,,, ,:,,,,:,;,,,:,:,,:,,:,,;,,，,， ,;,,,,,，,,;,, ,,,, ,,，,南分离株进 化 分 析 及 基 因 的 表 达 农 业 生,,,,,,,,,,:,,, ，,, ，，，，，，,,,,物技术学报,，,,;,, ，，,,， ，,,:～,,;:;,,,,:, ,;,;:,,:,,::,,,,,,,,,,, , ,,,:～,,,:,;,,,,,,:,:,,;,:,:,,;:,,::,,,～,!,,,，，,,,,萨母布鲁克 拉塞尔 分子克隆实验,:，, ,,, ,,，，,,,，, :,,，,;,,;,,:::,,,,,,,,, ,，版黄培堂主译北京科学出版社, ,,,::,, ,, ，，，,, ，，，,,,,,,:～,,, ,,～;,:,,,:,;,,,,,,,,, , ，;,,,,,,,,,,,,，;,,;,,,:，;,,,,;,,,,，,;,,,;,,,,!!, ,;,,,,,～,,,,,,:,;:,,:, :,,,,,; ,,,,,, :,,,;,:,～:,,:,:,,;,;,;,,,,,,,,,;,,;,::,,,;:,,:,,, !,,,,,!, ,,:,,,,,,～:,:,,;:,,::,,,～,,,,:,:,,;,,,:,,,～,,,;,,:,,,,,,,,,,:,;,,,,,:,:,,;:,,::,,,,,,,,,!!,, ，，,,,,,,,，，,，::,,,,～:,,,,,,,,,,,,,～,,,:,,,:,;,,,，,,,::,,;,::,,:,,,,,,,,,, ,, ，，，，，，,,,,,,;,,～, ,，,,,～,, ,,,,,,;,,,,,;,;,,::～,,,:，,,,,,～,,,,,:;, , ,,,,,,,, , ，;,,,,，,,,, ,,,～,,,,,,:,,,,,,,,:,,,,,～:,～,,,,:,;,,,,，,,;,,,,,,:,:,,;,:,:,,;:,,::,,,～,,:,,,,:,,,!!,,, ,,，，,,,::,,,,,:,:,,,:;，,,,::,,;,::,,,,,,,,,,,,,, ,,,～ :,,,;,,,,,～～,,,,;,,: ,,,,,,,,,,,,, !, !, ，，，,,王先炜姜 平李玉峰等猪圆环病毒 型 蛋,,,:,,,:,;,,,,,,;,;,,;:,,～,:,;,:,,:,，:,,～,,;,,? , ,,,,, ,,，，白重组腺病毒的 构 建 及 鉴 定中 国 病 毒 学，,,::,:,,,, ,;,;,:,;,,:,, ,,,,;,,,,, ,:,,;,,,,:,,:, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,～:,,:,～,,,,,,,,:,;,;:,,,,,,,,,,,!,!, ，，，,,欧阳素 贞张 福 良王 双 山等猪 圆 环 病 毒 型 ,, :,,,,;,;,,,,,;,;,,;;,,,,;:,,:,, ,,,～ ,:,, ,,, ,:,,,,, ,,，，,,,,,蛋白重组腺病毒的构建 及 表 达中国预防兽医学 ，,，,，:,,, ,,:,:,,:,,:::,,,,,,,,:,, ，，,,,，，，,,报,,,,～;,,,,,:～,,,,,,～:,:;,,,,,,,,;,;,,,,,,;:,,::,,:,,,,,,,,,,