异质性胞核核糖核蛋白、小核核糖核蛋白与自身免疫性疾病

异质性胞核核糖核蛋白、小核核糖核蛋白与自身免疫性疾病 异质性胞核核糖核蛋白、小核核糖核蛋白与 自身免疫性疾病 医堂Q生篁鲞蔓三 - 专笔谈- 异质性胞核核糖核蛋白,小核核糖核蛋白与自身免疫性疾病 王国锋于孟学李薇1刘小军于健宁3 在真核细胞,异质性胞核核糖核蛋白(heteroge. nousnuclearribonucleoprotein,hnRNP)与小核核糖 核蛋白(smallnuclearribonucleoprotein,snRNP)共同 参与mRNA成熟的过程.研究发现,hnRNP复合体 家族至少包含20种以上功能各异的RNA结合蛋 白,它们的分子大小及等电点均不相同.新转录的 mRNA前体和约30种不同的核蛋白组成不均一核 糖核蛋白颗粒,hnRNP再与细胞核内的snRNP颗粒 构成剪接体,剪去内含子,连接外显子,完成mRNA 前体的转录后加工….近年来研究表明,hnRNP和 snRNP是自身免疫性疾病中免疫应答的重要靶抗 原,其不同亚型对不同疾病具有特异性,抗hnRNP 抗体和抗snRNP抗体在自身免疫性疾病的发病和 诊断中具有重要意义.我们着重对抗hnRNP抗体和 抗snRNP抗体的研究进展综述如下. 一 ,hnRNP家族与snRNP家族 1.hnRNP:异质性胞核RNA(hnRNA)是在真核 细胞中蛋白编码基因通过RNA聚合酶II形成的转 录子,有20余种核酸结合蛋白与之结合,形成 hnRNP复合物.这些核酸蛋白根据所结合蛋白质的 分子质量,以字母顺序命名为hnRNPA(34ooo), hnRNPU(120000)t.hnRNA在由hnRNP和snRNP 构成的剪接体内进行内含子的剪接,以及5'端帽子 与3'端多聚腺苷酸合成加工形成成熟的mRNA.除 此之外,hnRNPs还在去除内含子连接外显子的剪接 过程,RNA运输到胞浆,RNA输出及mRNA的胞浆 代谢等方面具有作用口].hnRNP存在于所有真核生 物的细胞和组织内,主要位于核内,在进化中也是高 度保守的.Fritzsche等[4用质谱飞行时间的方法在 几种肿瘤细胞系的细胞质膜上分离并鉴定到了 hnRNP家族中的几个成员,表明hnRNP中少数成员 可能在细胞质膜也有表达,同时具有白蛋白结合特 性.几乎所有的hnRNP蛋白都有RNA结合序列,对 RNA具有高亲和性.hnRNP在剪接体中具有一定的 控制作用,这些蛋白与其他剪接因子的相对水平能 影响交替剪接的模式,因而影响基因的表达. 2.snRNP:snRNA是在真核细胞核内的一组小 分子RNA,约含50~200个核苷酸,故称为小核RNA. 它们与有关蛋白结合形成的snRNP,主要在加工 RNA前体,切除多余的片段(如内含子)时发挥重要 作用.snRNA在核内转录,在胞浆组装,而发挥功能 却在核内,故需跨核膜转运.由于这组小分子的 snRNP中尿嘧啶含量丰富,故snRNP又被称为 UsnRNP.现已发现,哺乳动物细胞中的UsnRNP至 少有13种(U1-U13),大都分布于核质.6种富含u 的snRNA(U1~U6)大量存在于动物细胞核,除U3 在核仁参与pre—rRNA加工外,其他5种u系列 snRNA均存在于核质hnRNP中,其结构特征提示它 们参与pre—mRNA剪接.典型剪接复合体由5种 snRNP组成,每种snRNP均由1种snRNA(分别对 应称U1,U2,U4,U5和U6)与6-10个对应蛋白构 成.具体过程大致为U1和U2复合物分别识别结合 内含子的头部切点和分支点,然后由U4和U6复合 物将它们连接起来,最后U5复合物加入形成剪接 复合体并与头,尾切点接触,内含子以套索样结构被 切除,而两侧的外显子准确地连接起来【5]. 二,抗hnRNP抗体和自身免疫性疾病的关系 hnRNPs包括和Pre—mRNA相关的30种小蛋 白,均具有结构相关性,与自身免疫性疾病相关密 切.9种不均一的核心蛋白被分为A1,A2,Bla,B1b, Blc,B2,C1,C2,C3C. 1.抗hnRNPA1抗体:Astaldi—Ricotti等[6]发现, 22%(7/31)系统性红斑狼疮(SLE),50%(22/44)类风 湿关节炎(RA),40%(2/5)混合性结缔组织病 (MCTD),1l%(6/56)其他结缔组织病(CTD)患者血 清中存在抗hnRNPA1抗体,而25例健康供血者和 l5例患其他慢性病者血清中则不存在该抗体.大多 1.中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫 科(邮编100730) 2.河南省新乡医学院第三附属医院内科 3.浙江省中西医结合医院风湿肾病科 通讯作者 数抗hnRNPA1抗体阳性血清也含有抗hnRNPA2 抗体.在抗hnRNPA1,A2抗体双阳性血清中,常可 见到两种抗体问的交叉反应.在SLE和MCTD中抗 hnRNPA2抗体比抗hnRNPA1抗体更易被检出. 2.抗hnRNPA2/B1和B2抗体(即抗RA33抗 体):Hassfeld等[7首先用免疫印迹法(IBT)在约36% 的RA患者血清中检测到一种抗相对分子质量为 33000的核提取物的抗体,特异性为99.6%.作者认 为在一定程度上有标记物的特性,命名为抗RA33 抗体.抗RA33抗体检出的同时还存在针对相对分 子质量36000,31000,25000,20000等抗原的抗 体,其中抗36000抗体对RA的诊断有特异性.经 纯化和测序证明,RA33抗原与hnRNPA2蛋白质等 同,并且发现抗RA33抗体还能识别hnRNPB1,B2 蛋白质.因此,抗RA33抗体实际上是能与hnRNP 蛋白质A2,B1,B2(RA33复合物)特异性结合的自身 抗体. 国内外学者采用HeLa细胞和Ehrlich腹水癌 细胞提取的核抗原对此抗体进行检测,认为对RA 有,定诊断价值,其敏感性为20%-40%.由于抗 RA33抗体在RA发病早期就可出现,因此检查抗 RA33抗体有助于RA的早期诊断,尤其是当类风湿 因子(RF)阴性时.此外,抗RA33抗体还有助于区分 早期RA与其他形式的关节炎,如银屑病关节炎,强 直性脊柱炎,骨关节炎等.抗RA33抗体的存在与 RF,抗角蛋白抗体(AKa),抗核周因子(APF)及抗 CCP抗体等自身抗体均无相关性,与患者的年龄,性 别,病情进展的分期,病程的长短,病情活动性及是 否使用缓解病情药物无关,其阳性率在不同人群中 不同,如芬兰和希腊的RA患者抗RA33抗体阳性 率较低,而非高加索地区的SLE患者该抗体阳性率 较高.抗RA33抗体与RA,SLE等疾病的某些临床 特点有一定的相关性,如合并类风湿性血管炎的 RA患者,其抗RA33抗体的阳性率较高,在RF阴 性的RA患者中抗RA33抗体更常见.目前虽无证 据表明抗RA33抗体涉及RA,SLE或MCTD的发病 机制,但在非高加索地区的SLE患者中,抗RA33抗 体与严重的侵蚀性关节炎有关,推测它可能是引起 RA和SLE关节破坏的因素之一[7].周志杰等[在检 测抗RA33抗体的同时,发现了能与相对分子质量 为36000的抗原特异性结合的抗体,命名为抗 RA36抗体,推测其相应抗原是hnRNPB1蛋白,并 认为抗RA36抗体是RA的特异性抗体,如果同时 E京医学2oo6年第28卷第5期 出现抗RA36及RA33抗体,则更有利于诊断. 抗RA33/36抗体主要存在于RA患者中,但还 可出现于SLE和MCTD中,阳性率分别为25%一 40%和40%60%.1992年Steiner等[91利用纯化 RA33作抗原,33%RA患者抗hnRNPA2/RA33抗体 阳性同时,在SLE和MCTD患者中阳性率分别为 20%(2/10)和40%(4/10),而这6例非RA患者又都 有U1RNP抗体存在,其他炎症性和退行性关节炎患 者均为阴性.1995年Hassfeld等[1o1重复相似的实 验,发现抗hnRNPA2/RA33抗体在RA,SLE,MCTD 患者中的阳性率分别为35%,23%,38%.在SLE 患者中,抗hnRNPA2/RA33阳性血清率与抗Sm,抗 U1RNP抗体检出率显着相关.由于hnRNP与 snRNP二者是并联在一起的剪接体,故机体可针对 这一并联体产生自身免疫反应.RA患者免疫应答 产生的自身抗体的限制性较强,只针对hnRNP,而 SLE和MCTD患者产生的针对snRNP的抗体可能 与hnRNP产生交叉反应或针对hnRNP的抗RA33 与snRNP出现交叉反应,造成抗RA33在这两种疾 病中出现. 3.抗hnRNPI抗体:hnRNPI由557个氨基酸? 组成,分子质量为59632,等电点为9.86.其基因编 码序列包括单一的开放阅读框架,cDNA由1671bp 核苷酸组成,另外还有3'非翻译区1561bp,其中包 括60个多聚A尾巴.Ghetti等"用单克隆抗体对 Hela细胞进行免疫荧光检测的结果表明,hnRNPI 蛋白与hnRNP家族中大多数蛋白相同,主要定位于 核浆而非核仁,同时核仁周围某些特定结构也有不 连续荧光染色出现.故临床上抗核抗体检测可能出 现除核仁及核模型外的其他核型. 20世纪90年代以来,国外文献报道hnRNPs是 风湿免疫性疾病中自身免疫应答的重要靶抗原. Fritzler等[最早报道了抗hnRNP抗体与SLE, MCTD及RA等自身免疫性疾病的关系.1996年 Montecucco等[1首次发现抗hnRNPI蛋白的抗体与 系统性硬皮病(SSc)临床表现相关.他们利用分子克 隆技术,在大肠杆菌中表达了特异性产物并进行纯 化,得到的重组蛋白近似分子质量约为60000.应 用ELISA及免疫印记法对重组hnRNPI进行临床 检测(101例结缔组织病,40例正常对照),结果在 SLE及MCTD患者血清中均未检测到这种抗体.早 期及局限型SSc患者的阳性率(15/24例,62.5%)高于中期和弥漫型SSe(7/16例,43.8%),且与抗Scl— 京医学2O06年第28卷第5期 70和抗着丝点抗体无明显相关,故得出抗hnRNPI 抗体在早期或局限型SSc出现率高于中期或弥漫型 SSc的结论,从而提示对SSc患者值得进行该抗体 检测,且高滴度阳性具有疾病特异性.以上研究均表 明了,SSc的hnRNPI蛋白与RA,SLE相关的hn. RNPA/B蛋白可能分别为不同种类免疫反应之特异 性靶抗原,它们可能分别与处于不同功能的hnRNP 复合物相关联,并诱发不同的免疫反应. 三,抗snRNP抗体与自身免疫性疾病的关系 目前已知snRNPs有多个成员,Sm和RNP抗原 即属于snRNP家族,其中Sm抗原对SLE具有高特 异性.研究认为snRNP抗原是作为剪接体复合物参 与细胞核内RNA成熟过程的蛋白质,至少包括9种 不同的多肽,根据它们在SDS—PAGE的电泳迁移速 率不同,即分子质量大小分别命名为SmB,B',B3, D1,D2,D3,E,F及G.所有这些多肽蛋白均可成为 自身免疫性疾病的靶抗原,但B,B'及D1与其他组 分相比较对SLE具有更高的亲和力【1. 1.抗Sm抗体:lsnRNP中能被抗Sm抗体识别 的蛋白组分被称为Sm共同核心(commoncore),Sm 共同核心主要存在于除U3snRNP以外的U1,U2, U4/6和U5snRNP中.已知蛋白多肽的分子质量为 9000~29500[]:B(B1;28ooo),B'(B2;29000),N (B3;29500),D1(16000),D2(16500),D3(18ooo),E (12ooo),F(11ooo)和G(9000). 抗Sm抗体对SLE的诊断具有较高特异性,是 ARA1982年修订的SLE诊断标准中的一项指标,是 目前公认的SLE的血清标记性抗体,在SLE中的阳 性率为20%,40%.但抗Sm抗体阴性并不能排除 SLE诊断.早期抗Sm抗体在SLE中阳性率约为 30%,特异性为100%,对早期不典型SLE的诊断有 重要意义.对一些暂时不满足SLE诊断的早期病例 或可疑病例,如果抗Sm抗体阳性,再结合其他临床 表现仍应考虑SLE的诊断.多数文献报道,抗Sm抗 体与SLE的临床表现及病情活动性无任何关系. 2.抗U1RNP抗体:由于抗U1RNP抗体对结缔 组织病的诊断及鉴别诊断具有重要临床意义,而其 他抗URNP抗体虽然可出现在SLE等CTD患者中, 但阳性率较低,故临床常规检测抗RNP抗体主要以 检测抗U1RNP抗体为主.抗U1RNP抗体的抗原决 定簇位于与UIRNP相连接的蛋白多肽上,其成分至 少包括9种蛋白多肽所组成的复合物,其中主要成 分为U1—70K,U1A和U1C蛋白,相对分子质量为 70oo0或680oo,320oo和17500[].与U1RNP 反应的抗体分为两类:一类含有抗Sm抗体,它直接 与Sm蛋白反应,在SLE患者中有特异性.另一类含 有抗U1RNP抗体,与UIRNP有特异性反应,主要 与U1-70K,U1A和U1C中的一种或几种蛋白发生 反应.由于U1RNP抗原与SmB/B'抗原有部分共同 抗原决定簇,故抗Sm抗体阳性均伴有U1RNP抗体 阳性,但U1RNP抗体阳性可不伴有抗Sm抗体阳 性.抗Sm抗体阴性而高滴度抗U1RNP抗体阳性是 MCTD的特点_l6l. 高滴度的抗U1RNP抗体是MCTD诊断的重要 指标,几乎出现于全部MCTD患者中.出现高滴度 的抗UIRNP抗体(尤其是抗一70KU1RNP抗体),且 无其他特异性的抗核抗体,是诊断MCTD的重要血 清学依据.抗RNP(包括抗U1RNP)抗体可在多种风 湿病中出现,并不具有诊断特异性.抗U1RNP虽被 认为是MCTD标志性抗体,但在SLE中的出现率也 不低,为30%,40%,可伴有Sm抗体出现或单独出 现,其他结缔组织病中阳性率分别为:全身性硬化症 (SS)14%,多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)15%_1.在抗 U1RNP抗体阳性的MCTD或SLE患者中,常与肌 炎,食管蠕动功能低下,雷诺现象,关节痛,指硬化和 肺的间质性改变等临床症状密切相关,且此抗体阳 性的患者肾炎的发病率极低_1引.有人认为抗U1- 70K在MCTD中更具标志性,而另有报道称二者无 直接相关,但抗U1—70K与指(趾)骨挛缩相关_l. Burdt等[观察到近100%MCTD在初期抗U1—70K 已出现,进入缓解期后抗U1—70K转阴.另有研究发 现,在皮肤症状出现的同时抗U1—70K已出现_1引.总 之,抗U1RNP抗体包括抗U1—70K抗体均可在SLE 和MCTD中出现,当其高滴度时应首先考虑MCTD; 当它与重叠的特征相关时则应考虑SLE. Ihn等对223例系统性硬化症(SSc)研究发 现,在局限性SSc即肢端硬化患者中,抗U1RNP阳 性率(14%)明显高于弥漫性SSc(3%).在SLE伴抗 U1RNP阳性的血清中可测得抗Sm,但在抗U1RNP 阳性的SSc及MCTD中未测到抗Sm,发现抗U1- 70K在抗U1RNP阳性的SSc及MCTD中的出现率 高于SLE. 3.抗U3RNP抗体:抗原纤维蛋白抗体(anti-fib- rillarinantibodies)又称抗U3RNP抗体,抗U3核仁 RNP抗体,抗U3一snRNP抗体和抗Scl一34抗体等. 抗原纤维蛋白抗体的靶抗原为的原纤维蛋白,是一 ?298- 种位于核仁密集原纤维丝蛋白结构上的与U3RNA 结合的34kd碱性蛋白,也是参与核糖体RNP前体 成熟过程的核糖核蛋白粒子的组成成分[2.抗原纤 维蛋白抗体为SSc的特异性抗体,阳性率为5%一 10%.主要见于无关节炎和肺纤维化症状的SSc等 患者中,该抗体阳性常与肌肉,肺,心脏受损相关联, 且男性患者的发生率(33%)高于女性患者(14%),黑 种人发生率高. 总之,异质性胞核核糖核蛋白与小核核糖核蛋 白在核内共同参与了mRNA成熟的过程,它们同时 也是自免疫性疾病的重要靶抗原.抗hnRNP抗体和 抗snRNP抗体不仅是有价值的诊断指标,而且在 自身免疫性疾病发病机制和治疗的研究中也具有重 要意义. 参考文献 1.DreussG,MatunisMS,Pinol—RomaS,eta1.HnRNPproteinsand thebiogenesisofmRNA.AnnuRevBiochem,1993.62:289. 2.BiamontiG,GhignaC,CaporaliR,eta1.Hetemganeousnuclearri- bonueleopmteins(hnRNPs):Anemergingfamilyofautoantigensin rheumaticdisease.ClinExpRheumatol,1998,16:3l7—26. 3.SwansonMS,DreyfussG.Preparationofheterogeneousnuclearri- bonucleopmteincomplexes.MethodsMolBiol.1999,118:299—308. 4.Frltz~heT,SchnoherM,FiedlerS,eta1.Isolationandidentifies- tionofhetemgeneousnuclearribonucleoproteins(hnRNP1frompu- rifledplasmamembranesofhumantumourcelllinesasalbumin— bindingproteins.BiochemPhacmacol,2004,15,67:655—665. 5.BrahmsH,RakerVA,vanVenrooijWJ,eta1.Amajornovelsys- temiclupuserythematosusautoantibodyclassrecognizestheE,F, andGSmsnRNPproteinsasaI1E-F-Gcomplexbutnotintheir denaturedslates.ArthritisRheum,1997,40:672—682. 6.Astaldi-RicottiGCB,BestagnoM,CerinoA,eta1.Antibodiesto hnRNPcorepmteinA1inconnectivetissuediseases.Jcell Biochem,1989,40:43—47. 7.HassfeldW,SteinerG,HartmuthK,eta1.Demonstrationofanew antinuclearantibody(anti—RA33)thatishighlyspecificforrheuma- toidarthritis.ArthritisRheum,1989,32:1515—1520. 8.周志杰,蒋明,宋琴芳.抗类风湿关节炎36KD和33KD抗体对类 风湿关节炎诊断意义的研究.中华内科杂志,1994,33:251—53. 9.SteinerG,HartmuthK,SkrinerK,etal,Purificationandpartial sequencingofthenuclearautoantigenRA33showsthatitis indistinguishablefromtheA2proteinoftheheterogeneousnuclear ribonucleopmteincomplex.JClinInvest,1992,90:1061—1066. 北京医学2006年第28卷第5期 10.HassfeldW,SteinerG,GranningerW,eta1.Autoimmuneresponse tothesplicesome.Animmunologiclinkbetweenrheumatoidarthri- tis,mixedconnectivetissuedisease,andsystemiclulSuserythe* matosus.ArthritisRheum,1995,38:777—785. 11.GhettiA,Pinol—RomaS,MichaelWM,eta1.hnRNPI,thepolypyrimi- dinetract-bindingprotein:distinctnuclearlocalizationandassocia- tionwithhnRNAs.NucleicAcidsRes,1992,20:3671—3678 12.FritzlerMJ,AliR,TanEM.Antibodiesfrompatientswithmixed connectivetissuediseasereactwithheterogeneousnuclearfibonu, cleopi'oteinorribonucleicacid(hnRNP/RNA)ofthenuclearmatrix. 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