免疫荧光技术

免疫荧光技术 利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。 (一)细胞膜蛋白分子的检测 原理: 细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量 1 直接法:细胞，荧光素标记的抗CD分子的抗体?4ºC反应30-60min?荧光显微镜观察或流式细胞计分析。 2 间接法:细胞，抗CD分子的抗体?4ºC 反应30-60min 荧光素标记的二抗 4ºC 反应30-60min?荧光显微镜观察或流式细胞计分析 悬浮细胞:用PBS洗二次后再做染色 贴壁细胞:先用胰酶消化成悬浮细胞再染色 2 Annexin V检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标) 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 样本处理和染色方法 1 悬浮细胞的染色:将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul，室温避光30min，再加入PI(50ug/ml)5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h)， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。 2 贴壁培养的细胞染色:先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。 3 爬片细胞染色:同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 (二)细胞内蛋白分子的检测 细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白TFAR19的检测等。 操作过程: (1)直接法: 细胞?3,多聚甲醛固定和 渗透化?封闭?荧光素标记的抗体? 洗涤?荧光显微镜观察或流式细胞计分析 (2)间接法: 细胞?3,多聚甲醛固定和渗透化?封闭?针对蛋白的特异抗体?洗涤?荧光素标记的二抗?洗涤 ? 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19(PDCD5)是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素(FITC)标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。 1 悬浮细胞的染色: (1)收获正常和诱导凋亡的细胞(0.5~1×106)，PBS洗2次， (2)3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。 (3)加入PBS-T溶液，37?C孵育15min，PBS洗2次， (4)加入200ml胎牛血清，室温反应30min。 (5)加入 FITC标记的TFAR19单抗，4?C反应30min (6)荧光细胞洗液洗2次，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。 2:贴壁细胞的原位染色 (1) 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中(内有洁净盖玻片)，让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。 (2) 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。 (3) 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油(5ul)的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。