白细胞介素_对登革病毒感染人血管内皮细胞的影响

白细胞介素_对登革病毒感染人血管内皮细胞的影响 白细胞介素 ?对登革病毒感染人血管内皮细胞的影响 杨春华 江振友 ( β) β摘要 目的 :探讨白细胞介素 ?IL21:用不同浓度的 IL21 方法 在登革病毒发病中的作用 ,以及登革病毒感染的发病机理 。 (( ) () ) 分别作用于登革 ?型病毒 DV感染人脐静脉内皮细胞 HU V EC的不同环节 病毒感染前 、感染同时 、感染后。于感染后不 2 ββ同时间收集感染上清液 ,用微量蚀斑法滴定病毒产量 。结果 : IL21对人脐静脉内皮细胞中的 DV 增殖有抑制作用 。IL21在 2 β实验浓度范围内不造成血管内皮细胞形态和数量的改变 。结论 : IL21在防止或减轻登革病毒感染发病中起重要作用 。 内皮 细胞因子关键词 登革热病毒 血管 中国图书资料分类法分类号 R 373 . 33 R 322 . 12 β Eff ect of IL21ondengue virus inf ect ion of human vein en dothel ial cell s Yang Chunhua ,J iang Zhenyo u ( )Dep a rt m en t of Dis pensa ry , A f f i l i ated Hos pi t al of B en gbu M edical Col lege , A n h ui 233004 β β Abstract Object ive : To st udy t he effect of IL21o n t he pat hogenesis of dengue fever . Methods : IL21in ( )different co ncent ratio ns were incubated separately wit h human unmbilical vein endot helial cells HU V EC befo re ,during and af ter DV infectio n . Cult ure super matant s were collected and tit rated fo r virus co ncent ratio ns 2 β by microplaque fo r ming assay at different time intervals f ro m 24 to 96 ho urs po stinfectio n . Results : IL21 βinhibited t he multiplicatio n of DV in EC. Wit hin t he range of IL21co ncent ratio ns used in t he experiment , no 2 changes in mo rp hology o r number of cells were fo und bot h in no r mal o r DV infected HU V EC. Concl usions : 2 βIL21plays an impo rtant role in auceliocating t he dengue virus infectio n . Key words dengue virus ; bloo d vessels ;endot helium ;cyto kines β() ( ) = 1?1 。IL21gma 公司。 BM 公司。牛血清白蛋白 Si() 登革病毒感染可引起登革热 D F、登革出血热( ) 1 . 2 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 HU V EC的 培 养 和 鉴 定 用 () () D HF及登革休克综合征 DSS,D HF/ DSS 病死率 0 . 125 %胰酶 ED TA 液灌注冲洗法 ,从人脐静脉中分离出血 高 , 是 东 南 亚 地 区 儿 童 住 院 及 死 亡 主 要 病 因 之 管内皮细胞 。用相差倒置显微镜与透射电镜观察细胞形态 、〔1〕一。鉴于登革病毒感染的严重并发症 D HF/ DSS W2P 小体 、ABC 酶标法检测胞浆中第 ?因子相关抗原 。 的病理改变与血管内皮细胞关系密切 , 笔者观察 1 . 3 DV 甲基纤维素微量空斑滴定法 用培养 24 h 的白 2 6 βIL21在登革病毒感染人脐静脉内皮细胞中的作 纹伊蚊 C细胞接种 24 孔板 ,每孔细胞数 1 ×10,细胞贴 6/ 36 壁后加入不同稀释度的待测上清 , 每孔 0 . 2 ml , 37 ?吸附 用 ,试图对登革病毒感染的发病机制进行探讨 ,为临 2 h ,用毛细吸管吸出 ,洗涤 ,加入 1 . 2 %甲基纤维素 Eagle’s 床治疗提供实验依据 。 覆盖液 ,每孔 0 . 8 ml ,37 ?培养 2,3 d ,显微镜下观察蚀斑形 成情况 ,待蚀斑大小合适时 ,弃去覆盖液 ,洗涤后再用 0 . 8 % 1 材料与方法结晶紫染色 5 min ,自来水冲洗后 ,显微镜下空斑计数 : 1 . 1 材料 正常分娩或剖宫产的新生儿脐带 。登革 ?型病 ( ) 毒 New Guinea C 株 DV , N GC 株中国药品生物制品鉴定 2 待测标本病毒滴度 样本每孔空斑均数 ×稀释度( 所惠赠 。C细胞株 白纹伊蚊细胞株 ,广东省卫生防疫站 6/ 36 = 0 . 2 ml ()pf u/ ml ) 赠。20 % FCS 1 640 培养液 : 20 % FCS , 牛视网膜提取物 β1 . 4 IL21对 DV 感染血管内皮细胞的影响 用 10 % FCS 2 ( ) μ) ( ( RDS300g/ ml , R PM I 1 640 Gibco 公司, Hepes Merck 公 β 1 640将 IL21配 制 为 高 、中 、低 三 种 浓 度 , 分 别 为 1 000 ) μ司5 g/ L , L2谷胺酰胺 30 g/ L , 青霉素 100 u/ ml , 链霉素 u/ ml 、100 u/ ml 、10 u/ ml 。用 10 % FCS 配制 BSA 浓度为 500 μμ100 g/ ml ,卡那霉素 100 g/ ml 。2 % FCS Eagle’s 维持液 。 μβg/ ml 。各种浓度的 IL21和 BSA 在使用时都稀释 10 倍 ,故 ( ) ( 甲基纤维素 Sigma 公司。96 孔 、24 孔塑料培养板 Corning 其最终作用浓度缩小 10 倍 。将传代 24 h 的 HU V EC 加入 ) 4 公司。0 . 125 %胰酶 ED TA 液 : 0 . 25 %胰酶?0 . 02 % ED TA( ) 24 孔培养板 ,每孔含 6 ×10EC 。20 % FCS 1 640 含 RDS β作为传代 EC 的营养液 。实验设计用 IL21和 BSA 作用于 三个环节 :病毒吸附前与细胞孵育 24 h ,病毒吸附时与细胞 β(孵育 2 h DV 感染 EC 的吸附时间为 2 h ,即 IL21与 BSA 2 ( ) 作者单位 :233004 蚌埠医学院附属医院药剂科杨春华; 蚌埠医 ( )学院临床微生物学教研室江振友 ) 和 DV 同时作用于 EC 2 h 后吸出, 病毒吸附后分别加入 2 而抑制机体的免疫反应和损伤免疫系统。由此提示β IL21与 BSA 。阴性对照为 10 % FCS 1 640 。DV 感染剂量细胞因子在 DV 致病过程中可能起重要作用。 2 ( 5 pf u/ EC ,吸附时间为 2 h ,吸附后加入 10 % FCS 1 640 含 β( )表 1 病毒吸附前加入 IL21x ?s 及 BSA 对增殖的影响 ) RDS,每孔 0 . 5 ml 。细胞置于 37 ?, 5 % CO温箱培养 ,于 2 感染后 24 、48 、72 、96 h 分别收集培养上清液 ,用微量蚀斑法 3 () 病毒滴度 pf u/ ml×10 分组n 滴定病毒产量 。 24 h 48 h 72 h 96 h β1 . 5 IL21和 BSA 对正常和感染 DV 的人脐静脉 EC 数量 2 β 0 . 20 ?0. 058 . 06 ?2. 002 . 87 ?0. 611 . 47 ?0. 53对照组I L214的影响和形态观察 正常细胞组 : 用培养 24 h 的 HU V EC 0 . 18 ?0. 03 6 . 73 ?2. 61 2 . 10 ?1. 01 1 . 40 ?0. 40 4 4 1 加入 96 孔板中 ,每孔细胞数为 1 ×10,37 ? 2 h 后弃上清 , 0 . 18 ?0. 10 5 . 20 ?2. 10 2 . 47 ?0. 83 1 . 10 ?0. 40 10 4 β加入上述三种浓度的 IL21和 BSA ,每种浓度加 3 孔 , 每孔 0 . 14 ?0. 07 3 . 07 ?0. 31 1 . 20 ?0. 26 0 . 75 ?0. 60 3 3 3 100 4 μ20 l ,再补加维持液 0 . 18 ml 。DV 感染组 : 用 DV 感染接 2 2 0 . 22 ?0. 08 7 . 77 ?0. 12 2 . 93 ?0. 85 2 . 06 ?0. 81 BSA 4 ( ) 种于 96 孔板上的 HU V EC , 感染复数 MO I为 5 pf u/ cell , 0 . 71 5 . 53 3 . 48 2 . 92 F β37 ?吸附 2 h 后 ,弃去感染上清 ,洗涤后加入 IL21、BSA 及 > 0. 05 < 0. 01 < 0 . 05 > 0. 05 P 维持液 ,用量同前 。10 % FCS 1 640维持液作对照 。将上述 β( ) (μ) q 检验 :与其它各组比较 3 P < 0.0 5 IL21u/ ml,BSA 50 g/ ml各组置 37 ? 5 % CO条件下培养 48 h ,倒置显微镜下观察 2 各组细胞形态 ,然后用 0 . 8 %结晶紫染色 10 min ,自来水冲 β( ) 表 2 病毒吸附同时加入 IL21及 BSA 对增殖的影响 x ?s 洗后用二甲基亚砜脱色 。酶标仪 490 nm 处测每孔OD 值 。3 ( ) pf病毒滴度 u/ ml×10 分组n 24 h 48 h 72 h 96 h 1 . 6 统计学x ?s 表示 ,采用方差β 本文试验数字用 0 . 20 ?0. 029 . 67 ?1. 133 . 87 ?0. 401 . 75 ?0. 28对照组I L214 分析和 q 检验 。 0 . 22 ?0. 02 9 . 47 ?2. 20 3 . 57 ?0. 15 1 . 78 ?0. 32 4 1 0 . 20 ?0. 04 9 . 60 ?1. 58 3 . 70 ?0. 17 1 . 65 ?0. 28 10 4 0 . 21 ?0. 01 9 . 00 ?1. 92 3 . 57 ?0. 31 1 . 78 ?0. 27 2 结果100 4 0 . 22 ?0. 08 9 . 00 ?0. 80 4 . 17 ?0. 32 1 . 60 ?0. 43 BSA 4 2 . 1 从人脐静脉分离出的 HU V EC 在相差倒置显0 . 22 0 . 16 3 . 11 0 . 26 F 微镜下细胞呈鹅卵石样排列的单层 ,透射电镜下发 > 0. 05 > 0. 05 < 0 . 05 > 0. 05 P 现细胞胞浆中含有特征性 W2P 小体 ,ABC 酶标法显 示细胞胞浆中第 ?因子阳性 ,证明本次所分离的细 β( ) 病毒吸附后加入 IL21x ?s 表 3及 BSA 对增殖的影响 胞确为血管内皮细胞 。 3 ( ) 病毒滴度 pf u/ ml×10 分组n 24 h 48 h 72 h 96 h β2 . 2 IL21对 DV 在 HU V EC 中增殖的影响 高2 β 0 . 21 ?0. 067 . 47 ?0. 504 . 20 ?0. 601 . 77 ?0. 33对照组I L214β 浓度的 IL21在病毒吸附前加入能明显降低感染上0 . 21 ?0. 09 7 . 00 ?0. 60 4 . 10 ?1. 15 1 . 65 ?0. 22 1 4 ( β ) 清的病毒产量 P < 0 . 05; IL21低 、中两种浓度在 0 . 19 ?0. 03 7 . 03 ?0. 38 3 . 83 ?0. 47 1 . 72 ?0. 35 10 4 β病毒吸附前加入 ; 低 、中 、高三种浓度的 IL21在病 0 . 19 ?0. 06 6 . 80 ?0. 20 3 . 57 ?0. 25 1 . 67 ?0. 35 4 100 0 . 21 ?0. 11 7 . 30 ?1. 08 3 . 87 ?0. 93 2 . 06 ?0. 25 毒吸附同时加入和病毒吸附后加入对病毒增殖无影 4 0 . 09 0 . 71 0 . 43 1 . 19 ( ) 响 P > 0 . 05;B SA 对 DV 感染 EC 后的病毒增殖 2 F > 0. 05 > 0. 05 > 0 . 05 > 0. 05 () 无影响 见表 1,3。 P β2 . 3 B SA 和 IL21在实验浓度范围内 , 对病毒感 β本文结果显示 , IL21对 DV 复制的影响仅表 2 染的EC 和正常 EC 没有明显的损伤或增殖作用 ( ) () 现在高浓度 100 u/ ml 及病毒感染前效果明显 。见表 4。 βB SA 和 IL21在实验浓度范围内 , 对 DV 感染的 2 3 讨论EC 和正常 EC 没有明显的损伤或增殖作用 。B SA β 对 DV 感染 EC 后的病毒增殖无影响 , 提示 IL212 细胞因子在登革病毒感染中的作用尚不清楚 。主要是通过调节细胞的功能 ,而并非由于其本身是 〔2〕β有报道, IL21、IL26 、GM2CSF 对 DV 感染人皮肤 〔4〕蛋白质而影响病毒增殖 。J irik报道 ,体外培养的 成纤维细胞无明显影响 。此外 , DV 感染人单核细 β 血管 内 皮 细 胞 在 IL21的 诱 导 下 能 高 水 平 表 达 ( ) 胞可使尿激酶抑制物 PA I22浓度升高 ,从而影响纤 αβTN F和 IL26 ,因而本实验中 IL21对 DV 的抑制 2 维蛋白溶解 , 导致出血 。DV 感染还可诱导单核细 〔3〕α作用可能是通过诱导血管内皮细胞分泌 TN F而实 βα胞分泌 IL21和 TN F。DV 感染小鼠淋巴细胞 β现的 。实验发现 IL21在病毒吸附 、穿入阶段以及 可产生抑制因子 SF、SF及细胞毒因子 CF、CF,从 1 2 1 2 在 EC 内的增殖等阶段均无明显影响 ,原因可能是能在局部毛细血管内皮细胞及皮肤成纤维细胞上增 殖 。在此期间 ,体内多种因素与病毒相互作用产生 β当 DV 感染 EC 后 , 上述 IL21诱导正常 EC 表达 β多种细胞因子 ,其中 IL21一方面可抑制 DV 在 EC αβ TN F和 IL26 的能力丧失 , 因而不能表现出 IL21中的增殖 ,保护机体抵抗 DV 侵袭 ; 另一方面 ,过量 预处理正常 EC 抑制病毒产量的作用 。 β产生的 IL21能使 EC 表达多种免疫细胞粘附因子 , β表 4 IL21和 BSA 对正常 EC 和感染 DV 的 EC 数量影 2 直接损伤内皮细胞 ,引起 EC 形态和胞内骨架结构 的改变 ,引起血管通透性增加 ,导致出血 、休克 。在 ( ) 响 x ?s α机体感染 DV 的晚期 ,随着 TN F的增高 ,抗病毒作 ( ) OD 值490 nm 分组n 用增强 ,最后使感染恢复 。 正常 EC感染 DV 的 EC 2 参 考 文 献 β( ) 4 ?0 . 04?0 . 010 . 36 0 . 36 对照组 IL21u/ ml 0 . 33 ?0 . 03 0 . 35 ?0 . 02 1 4 0 . 32 ?0 . 01 0 . 33 ?0 . 02 10 4 1 Kurane I. Human T cell respo nses to dengue virus antigens 0 . 31 ?0 . 04 0 . 30 ?0 . 05 100 4 p roliferative respo nses and interfero n gamma p ro ductio n . J Clin 1 . 78 3 . 29 F ( ) ?506 Invest ,1989 ,83 3 > 0 . 05 > 0 . 05 2 Kurane I ,J anus J , Ennis FA. Dengue virus infectio n of human skin P 0 . 37 ?0 . 03 0 . 36 ?0 . 03 βfibro blast s in vit ro p ro ductio n of IFN2, IL26 and GM2CSF. Arch 4 对照组0 . 35 ?0 . 11 0 . 38 ?0 . 06 ( ) Virol ,1992 ,124 1?21 μ( )BSA 50 g/ ml ?4 0 . 35 0 . 60 ( ) Chang DM . Pro ductio n of interleukin21 IL21 and inhibito r by 3 t > 0 . 05 > 0 . 05 human mo nocytes expo sed to dengue virus. J Infect Dis , 1994 , 170 P ( ) 4?811 ?示 t′值J irik FR. Bacterial lipopolysaccharide and inflammato ry mediato rs 4 augment IL26 secretio n by human endot helial cells. J Immunol , 血管内皮细胞是 DV 的允许性细胞 ,不同细胞 ( ) 因子对 DV 在血管内皮细胞上的增殖有不同的调节 1989 ,142 1?144 〔收稿日期 1997211220〕 作用 。因此 ,推测 DV 经蚊虫叮咬进入人体后 ,很可 双原发性乳腺癌肉瘤、浸润性导管癌 1 例 姬玉芳 原发性双侧乳腺癌少见 ,双侧不同种类的乳腺癌肉瘤 、肿块大小为 2 . 5 cm ×1 . 8 cm ×1 . 5 cm ,切面灰白色 ,质较cm , 浸润性导管癌更为罕见 。现将 1991 年 6 月切除右乳腺肿块 硬 ,镜检见癌细胞呈巢状或腺样结构 ,向周围乳腺及脂肪组 ( ) 织浸 润 性 生 长 见 图 2 。免 疫 组 化 : ER + , PCNA 7 , 及 1997 年 7 月切除左乳腺肿块的病理特征分析如下 : C2erbB22 7 ,p53 6 , 8 , PR - 。病理诊断 : 左乳腺浸润性导 患者女 , 44 岁 。因右侧乳房外上象限无痛性肿块 , 于 () 管癌 。左腋窝淋巴结 2/ 17有癌转移 。 1991 年 6 月 17 日在南京军区总医院行肿块细针穿刺细胞学 讨论 双原发性乳腺癌既可同时发生 ,也可相继发生 , 诊断为恶性肿瘤 。于 1991 年 7 月在全麻下行右乳腺肿块根 ( ) 治术 。病理检查 :切除标本为 23 cm ×23 cm ×7 cm ,肿块大 均属多原发癌 。该例符合多原发癌的诊断标准 : 1此例乳 小为 5 cm ×4 cm ×4 cm ,呈分叶状切面鱼肉状 。镜检见典型 腺癌肉瘤根治术后 6 年之久 , 全身各处未发现可疑恶性肿 的腺癌图象 ,癌细胞周围间质见成片梭形 、圆形及卵圆形肉 () 瘤 ; 2两侧乳腺恶性肿瘤 ,右侧为癌肉瘤 ,左侧为浸润性导 ( ) 瘤细胞 ,似见软骨样细胞及大片粘液样基质 见图 1。免疫 组化标记 : 癌细胞 : EMA + , C K + , vimentin - ,肉瘤细胞 ; 管癌 。两种肿瘤类型不同 ,而且均各自位于乳腺组织本身 。vimentin + ,desmin - , EMA - ,C K - 。病理诊断 :右乳腺癌肉 ( ) 各自均有其独特的病理特征 ,免疫组化标记更具说服力 ; 3瘤 。腋窝淋巴结未见癌肉瘤转移 。1997 年 5 月 21 日患者又 ( ) 两侧肿瘤均位于各自的乳腺外上象限 ; 4两侧原发性癌均 发现左侧乳房外上象限压痛性包块 ,B 超检查提示左乳腺实 呈浸润性生长 ,而转移癌常呈膨胀性生长趋势 。双侧原发性 质性包块入院 。细针穿刺细胞学检查示乳腺癌 。右腋下淋 乳腺癌的早期发现 ,及时手术并配合放疗 、化疗效果较好 。 巴结转移性腺癌 。于 1997 年 6 月 26 日在全麻下行右乳腺 ( )本文图 1,2 见封二 肿块根治术 。病理检查 : 切除乳腺大小为 25 cm ×16 cm ×4 关键词 乳腺肿瘤 综合疗法 中国图书资料分类法分类号 R 737 . 9 〔收稿日期 1997211203〕 作者单位 :233000 蚌埠市第二人民医院细胞室