同卵双生子外周血DNA甲基化谱的差异

同卵双生子外周血DNA甲基化谱的差异 同卵双生子外周血DNA甲基化谱的差异 ? 260? 同 JournalofForensicMedicine,August201l,Vo1.27,No.4 卵双生子外周血DNA甲基化谱的差异 赵书民,张素华,陈金中,李士林,,李成涛 (1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点,上海200063;2.复旦大学生命科学学院 遗传学研究所遗传工程国家重点实验室,上海200433;3. 复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重 点实验室,上海200433) 摘要:目的通过比较不同个体外周血DNA甲基化谱的差异,评估DNA甲基化在同卵双生子个体甄别 中的应用价值.方法在知情同意基础上获得22对同卵双生子外周血样抽提基因组DNA后进行重 亚硫酸盐转化,采用Illumina公司的人27k甲基化微珠芯片检测基因组27578个CDG位点的甲基化程度 (值).依据常染色体CpG位点的值,采用欧氏距离计算方法计算同卵双生子间以72_同性别的无关个体 间的观遗传距离.比较同卵双生子对与无关个体对两组不同人群间的表观遗传距离差异结果同卵双 生子对人群以及无关个体对人群中的男性个体对与女性个体对的表观遗传距离差异均无统计学意义fP值 分别为0.0695和0.4825).同卵双生子对的表观遗传距离显着低于无关个体对人群(中位数:6.02vs7.20. P=0.0002),但两组人群的表观遗传距离均显着大于4.00(P<0.0001)结论同卵双 生子间的外周血DNA 甲基化谱差异显着,DNA甲基化是进行同卵双生子个体甄别的有效生物学标记 关键词:法医遗传学;yR.生,单卵;甲基化:个人识别 中图分类号:DF795.2文献标志码:Adoi:10.3969/i.issn.1004—5619.2011.04.006 文章编号:1004—5619(2011)04—0260—05 DifferencesofDNAMethylationProfilesinMonozygoticTwins'BloodSamples ZHA0Shu—rain|,ZHANGSu—hua,CHENJin-zhon{,LIShi—lin~,LICheng-taoI (1.ShanghaiKeyLaboratoryofForensicMedicine,InstituteofForensicScience,MinistryofJustice,PR.China, Shanghai200063,China;2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,InstituteofGenetics,Schoolof ,JSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China,"3.MinistryofEducationKeyLaboratoryofCon— temporaryAnthropology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China) Abstract:ObjectiveToevaluatethepotentialusefulnessofDNAmethylationinindividualdiscrimination ofmonozygotictwinsbyinvestigatingthedifferencesofDNAmethylationprofilesinmonozygotictwins' bloodsamples.MethodsBloodsamplesfrom22pairsofmonozygotictwinswereobtainedwithinformed c0nsent.GenomicDNAextractswerebisulfitetreatedfollowedbydetectionwithInfinium@HumanMethyla- tion27BeadChipAssays(Illumina,USA).Epigeneticdistancesbetweeneachpairofmonozygotictwinsand eachDairofunrelatedindividualsofsamegenderwerecalculatedwithEuclideandistancealgorithms.Dis— tributionofepigenetiedistanceinmonozygotictwingroupwasstatisticallycomparedwiththatinunrelated individuals.ResultsDifferenceofepigeneticdistancebetweenmaleandfemalepairswasnot statistically significantinunrelatedindividualgrouporinmonozygotictwingroup(P=0.0695and0.4825,respectively). Epigeneticdistanceofmonozygotictwinswassignificantlylowerthanthatofunrelatedindividualpairof samegender(Median:6.02vs7.20,P=0.0002).However,alltheepigeneticdistanceinmonozygotictwin grouporinunrelatedindividualsweresignificantlyhigherthan4.O0(P<O.0001).ConclusionDNAmethy一 1ationprofilesofmonozygotictwin'sbloodsamplesweresignificantlydifferentwitheachother,whichwas similart0thatinunrelatedindividualsofsamegender.TheseresultsindicatedthatDNAmethylationwas ausefulbiomarkerinindividualdiscriminationofmonozygotictwins. Keywords:forensicgenetics;twins,monozygotic;methylation;individualidentification 同卵双生子是由一个受精卵分裂发育而来的两 个个体.因此,理论上同卵双生子具有相同的基因组 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30901701):上海市自 然科学基金资助项目(09ZR1432800) 作者简介:赵书民(1973一),男,河南开封人,博士,副研究员, 主要从事法医遗传学研究:E—mail:zhaoshuminxl@hotmail.corn 通信作者:李成涛,男,博士.副研究员.主要从事法医遗传学 研冤:E—mail:lichengtaohla@163.conl DNA序列这就导致采用目前个体识别常用的遗传 标记,如STR,SNP或插A/缺失多态性(insertion/dele. polymorphisms.InDe1)等.无法对同卵双生子的 两个个体进行有效甄别l11.表观遗传学(epigenetics) 研究在没有DNA序列改变情况下发生的基因修饰和 功能变化,其机制包括基因组DNA甲基化,组蛋白的 甲基化和乙酰化等1.近年来,对同卵双生子和异卵 双生子表型差异的研究也发现.DNA甲基化等表观 法医学杂志2011年8月第27卷第4期 遗传修饰是导致同卵双生子问出现个体差异的主要 原因这些研究结果提示DNA甲基化等表观遗传 标记可能是进行同卵双生子个体甄别的有效工具.本 研究采用一种27k的全基因组DNA甲基化微珠检测 芯片对22对同卵双生子的甲基化谱进行检测,以评 价同卵双生子不同个体间DNA甲基化谱的差异. 1材料与方法 1.1样本 在知情同意的基础上.共获得22对同卵双生子 健康志愿者EDTA抗凝外周血样各2mL.其中男性 9对.年龄20,74岁:女性13对,年龄17—47岁. 1.2主要试剂和仪器 人全血基因组DNA抽提试剂盒(QIAampDNA BloodMiniKit)购自德国QIAGEN公司,IdentifilerTM 试剂盒购自美国AB公司.EZ重亚硫酸盐转化试剂 盒fEZDNAmethylation—G1odkit)购自美国Zymo Research公司.人27k甲基化微珠芯片试剂盒(Infini— um@HumanMethylation27BeadChipAssays)购自美 国Illumina公司InDeltyper30[8]为本实验室自制多重 分型系统.9700型PCR仪,3130XL遗传分析仪和 GeneMapperIDv3.2软件包均为美国AB公司产品. 芯片扫描仪(iScan)和GenomeStudio软件包均为美国 Illumina公司产品 1.3方法 1.3.1同卵双生子基因组DNA的提取 基因组DNA提取采用人全血基因组DNA提取 试剂盒,具体操作参见产品书提取好的基因组 DNA于一20?冻存备用 1-3.2同卵双生子验证 22对同卵双生子基因组DNA采用IdentifilerTM 试剂盒和包含30个InDel位点的自制多重分型系 统InDel— typer30在9700型PCR仪上分别进行多重 PCR扩增,扩增产物采用3130XL遗传分析仪进行毛 细管电泳,电泳数据采用GeneMapperIDv3.2进行 分析.比较同卵双生子对两个个体的Identifiler系统 和InDel_typer30系统的基因型分型结果 1.3.3DNA甲基化芯片检测 1.3.3.1基因组DNA的重亚硫酸盐转化 基因组DNA的重亚硫酸转化采用EZ重亚硫酸 盐转化试剂盒进行,操作依据产品说明书进行该 试剂盒的作用是将基因组DNA中未甲基化的胞嘧 啶转化为尿嘧啶重亚硫酸盐转化后的基因组DNA 于一20?冻存.并在1周内完成后续的DNA甲基化芯 片检测 ? 261? 1_3.3.2DNA甲基化芯片检测 重亚硫酸盐转化后的基因组DNA采用人27k甲 基化微珠芯片试剂盒检测人类基因组27578个CpG 位点的甲基化状态,由上海博星基因芯片公司提供商 业技术服务.检测过程依据该试剂盒操作说明书进行. l_3.4统计学处理 1.3.4.1CpG位点甲基化程度的计算 芯片扫描数据导入GenomeStudio软件包进行进 一 步分析依据Illumina公司所提供的算法,对每一 样本的背景信号进行均一化处理后计算每一样本每 一 个CpG位点的甲基化状态,即值.其计算公式为: 甲基化探针的信号强度 取值范围为0,1,0为无甲基化,1为100%甲 基化. 1.3_4.2重亚硫酸盐转化效率的评估 基因组DNA甲基化程度的检测结果受基因组 DNA重亚硫酸盐转化效率的影响对重亚硫酸盐转化 效率的评估采用管家基因fhousekeepinggene.HKG) 方法在本研究中采用两种常用的管家基因ACTB和 GAPDH进行重亚硫酸盐转化效率的评估理论上.二 者应为100%未甲基化.因此在本研究中重亚硫酸盐 转化效率可通过公式f2)计算得到: 重亚硫酸盐转化效率=l(2) 1.3.4.3甲基化芯片检测结果的重复性与稳定性评估 甲基化芯片检测结果的重复性通过2个样本的 重复检测结果的线性相关性进行评估.甲基化芯片 检测结果的稳定性采用x染色体连锁的管家基因 EFNB,和G6PD的甲基化程度进行评估理论上.由 于存在X染色体剂量补偿机制.X染色体连锁的管 家基因在女性样本中将表现为50%甲基化.在男性样 本中将表现为未甲基化 1.3.4.4同卯双生子问与无关个体问DNA甲基化谱 差异的评估 采用文献[10—11】提出的表观遗传距离(epigenet. icdistance,d)来评估同卵双生子间,无关个体间的 DNA甲基化谱的差异.表观遗传距离的计算采用的 是欧氏距离(euclideandistanee)计算方法若有一对 同卵双生子A和B,通过甲基化芯片检测共得到n个 CpG位点的值,则A和B间在这n个CpG位点上 的表观遗传距离(A,B)可通过公式(3)计算得到: (A,B)=,/—)2+雎)2+…+.)(3) 从22对同卵双生子中随机各选择1名.得到 13名女性和9名男性无关个体.将13名女性无关个 体和9名男性无关个体各自两两配对.分别得到78对 ? 262? 和36对同性别无关个体对,依据公式(3)计算每一对 无关个体间的表观遗传距离 同卵双生子人群与无关个体对人群间表观遗传距 离的比较采用Wilcoxon秩和检验.检验水准:0.05 2结果 2.1同卵双生子验证 每一对双生子样本经Identifiler'lN试剂盒和In. Del_typer30两种分型系统检测.基因型分型结果均 一 致,显示22对双生子均为同卵双生子 2.2重亚硫酸盐转化效率的估计 本研究所采用的lllumina公司的人27k甲基化 微珠芯片中包含了ACTB基因调控区两个C.G位点 (芯片中的标签号分别为:cg23175281和cg23261233), GAPDH基因调控区两个CpG位点(cg00241355和 cg20917484),上述4个CpG位点的值见图1,均显 着低于0.05fP<0.0001) O_04 0.03 o.02 O.01 0.00 1:cg23175281:2:cg23261233;3:cg00241355;4:cg20917484 图1管家基因ACTB和GAPDH4个CpG位点 的甲基化芯片检测结果 依据ACTB基因2个CpG位点的甲基化状态估 计重亚硫酸盐转化效率为0.9857.依据GAPDH基因 2个CpG位点的甲基化状态估计重亚硫酸盐转化效 率为0.9737. 2.3DNA甲基化芯片检测结果的重复性与稳定性检验 将1例女性样本和1例男性样本分别采用该芯 片进行重复检测,将两次检测结果的值进行相关 分析在女性和男性样本中,检测结果的重复性良好, 分别为0.9922和0.9935.见图2 DNA甲基化芯片检测结果的稳定性评价采用了 X染色体连锁的管家基因EFNB1上的3个CpG位 点(cg04907664,cg10950297和cg24139739)和G6PD 上的1个CpG位点(eg12536534).上述4个CpG位 点在女性和男性样本中的甲基化状态见图34个 CpG位点在女性样本中的甲基化状态平均为0.5040? 0.0663,与理论值0.5000差异无统计学意义(P= — J— ournalofForensicMedicine,August2011,Vo1.27,No.4 0.5420),在男性样本中的平均值为0.0336+0.0157. 显着低于0.05(P<0.0001). 毫 ,I 媒 l?O ,, 0.8 o.6 墼 羹 0.2 0.O0.20l40.60.8I.0 第一次检测结果(值) A:女性样本:B:男性样本 图2人27k甲基化芯片检测结果的重复性 O?7 0.6 0.5 螬0?4 qO.3 0.2 0.1 2.4无关个体对中表观遗传距离与年龄差距的关系 该芯片共包含27578个CpG位点.其中包括位于 x和Y染色体上的CpG位点共1092个.为了使不同 性别组的无关个体对间表观遗传距离具有可比性.剔 除上述位于X和Y染色体上的CpG位点后依据公 式(3)计算表观遗传距离.对同性别无关个体对的年 龄差距与表观遗传距离进行相关性分析.结果见图4 在男性和女性无关个体对中.二者相关性的Rz分别为 0.0537和0.0970 法医学杂志2011年8月第27卷第4期 年龄差距,岁 图4同性别无关个体对的年龄差距(岁) 与表观遗传距离的相关性 2.5同卵双生子对与无关个体对两组人群表观遗 传距离的差异 该芯片共包含27578个CpG位点.其中包括位 于X和Y染色体上的CpG位点共1092个.剔除上 述位于X和Y染色体上的CpG位点后依据公式(3) 计算d.同卵双生子和无关个体两组人群的表观遗传 距离分布见图5无关个体对人群和同卵双生子对人 群的表观遗传距离的中位数和四分位间距分别为 (7.20,6.20,9.20)和(6.02,4.88,6.74),均显着大于4.00 (P<O.0001)WilcOXOn秩和检验示.在无关个体对和 同卵双生子对人群内部.男性个体对与女性个体对间 的表观遗传距离差异无统计学意义f尸值分别为0.0695 和0.4825).而男性无关个体对与男性同卵双生子对 之间,女性无关个体对与女性同卵双生子对之间的表 观遗传距离差异有统计学意义(P值分别为0.0047和 0.0055,Bonferroni法校正'0.0125).无关个体对 人群的表观遗传距离也显着高于同卵双生子对人群 的表观遗传距离(0.0002).从图5还可以看出.无 论是无关个体对间还是同卵双生子对问,其表观遗传 距离均在4.00以上.同时可以发现在女性同卵双生 子对中出现一异常值,该对女性同卵双生子间的表观 遗传距离显着高于其他的同卵双生子对(圆点所示) 2O 艟 15 眷10 冒 5 :圆无关个体对口同卵双生子 . P:o004"7..P=O.ooo2 frr————] :5-P=0.0055.7- 卤自q- : 3讨论 同卵双生子的法医学个体甄别一直是法医物证 学所面临的难题之一.一方面是由于传统的可用于 ? 263? 个体识别的DNA多态性遗传标记(如STR,SNP和 IDel等)对同卵双生子不再有效I".本研究中所采用 的包括FGA等l5个常用STR基因座的IdentifilerTM 试剂盒以及包含30个具有高度多态性的InDe]位点 的InDeltyper30两个多重分型系统未能正确区分这 22对同卵双生子,也说明了这一问题.另一方面,目 前尚未见报道可用于同卵双生子个体甄别的生物学 遗传标记近年来,表观遗传学的进展提示了DNA甲 基化在同卵双生子个体甄别方面的潜在应用价值. 而本研究即是将表观遗传学的理论与方法应用于法 医物证学的一个尝试 将DNA甲基化这种表观遗传标记应用于同卵双 生子的个体甄别的前提是.要能够从表观基因组水平 筛选出在同卵双生子问甲基化水平存在明显差异的 CpG位点这就需要一种强有力的表观基因组水平的 DNA甲基化检测技术平台美国Illumina公司的推 出的人27k甲基化微珠芯片即是一种这样的DNA甲 基化检测工具3J在本研究中.为了保证检测得到的 同卵双生子两个个体间的DNA甲基化差异不是由于 技术方面的检测误差所致.课题组从常用的DNA甲 基化阴性对照基因【I4]f即常用的管家基因C他和 肋基因),X染色体连锁的管家基因[,3j(EFNB1 和G6PD)两方面考察了该芯片检测结果的稳定性 (图1和图3).结果显示在女性样本中.X染色体连 锁的管家基因(EFNB1和G6PD)上的CpG位点甲基 化程度均接近50%,这与经典的X染色体剂量补偿 机制相一致[91;同时,男性样本中X染色体连锁的管 家基因(EFNB1和G6PD)以及所有样本中的ACTB和 GAPDH基因上的CpG位点的均呈显着的低甲基化 (<5%).这些结果一方面表明了该芯片检测结果的稳 定性,同时也显示在芯片检测前的重亚硫酸盐转化过 程中,其转化效率也达到了理想的水平而重复检测 结果的高度一致性也进一步表明了该芯片检测结果 具有良好的重复性.上述研究结果与Bibikova等『l3J的 研究结果也是一致的.事实上,DNA甲基化芯片检测 结果的可靠性,稳定性和重复性也是发现同卵双生子 DNA甲基化谱差异的先决条件之一 表观遗传距离是目前常用的一种评估两份生物 样本表观基因组水平差异的指标[1o一".可通过高维空 间距离(即欧氏距离)的算法得到本研究的结果表 明,无论是在无关个体对人群中,还是在同卵双生子 对人群中,男性个体对与女性个体对的表观遗传距离 的差异均无统计学意义.但无关个体对人群的表观遗 传距离却显着高于同卵双生子对人群的表观遗传距 离(P=O.0002)这一结果与DNA甲基化这一表观遗 ? 264? 传标记的本质特征是一致的.DNA甲基化作为一种 表观遗传标记易受环境因素的影响而发生变化.如饮 食,疾病,药物,生活习惯等05].同卵双生子往往在这 些环境因素上较无关个体间具有更高的相似性.表现 在表观遗传距离上是同卵双生子问要低于无关个体 问.我们注意到在同卵双生子中存在一异常值(图5). 即第6对同卯双生子,是一对47岁的女性同卵双生 子.该对同卵双生子问表现出更为显着的表观遗传差 异,推测与其生活背景有关.在该对同卵双生子中.姐 姐为一农民艺术家,擅长水彩绘画.妹妹则务农.但事 实上,并不必对无关个体对人群与同卵双生子对人群 的表观遗传距离差异过分关注.因为在本组无关个体 对人群中还存在一混杂因素.即无关个体对间的年龄 差距,而对于同卵双生子而言.年龄差距为0但对同 性别的无关个体对的表观遗传距离与其年龄差距的 相关性进行分析发现.这一年龄上的差距并不是影响 同性别无关个体对表观遗传距离变异的主要因素 (图4).这一结果与Wang等_l】]研究晚发性阿尔茨海 默病时在健康对照组人群中的结果相一致 从同卵双生子个体甄别的角度看.同一个体在同 一 时间点的两份外周血样检测得到的表观遗传距离 的理论值应为O.而从图5则可以看出.虽然同卵双 生子对人群的表观遗传距离要低于无关个体对人群. 但仍均在4.00以上.这也清楚地表明了DNA甲基化 这种表观遗传标记在同卵双生子个体甄别中的有 效性. 本研究是采用DNA甲基化对同卵双生子进行个 体甄别的初步研究,采用的是外周血样本.要真正通 过DNA甲基化这种表观遗传标记实现同卵双生子的 个体甄别.还有大量的研究工作需要开展,包括从这 些CpG位点中筛选出甲基化程度在多数同卵双生 子均存在差异的位点,研究这些位点的时间稳定性 (即在多长的时间范围内甲基化程度能够保持相对稳 定,以及所筛选得到的CpG甲基化位点的组织特异 性等 参考文献: [1】yonWurmb—SchwarkN,SchwarkT,ChristiansenL,et . 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