肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力

肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力 ? 420? 东南大学 Un 学 iv嚣医c学iE版di;2009,0ct;28(5):420-42JSoutheastUnivMedScEd3()…一,,,. Astudytoassesstheeffectsofcombiningsalmeterol/fluticasonepropionateand respiratoryexerciseonpatientswithCOPD ZOUChun-fang.GUWei.CHENYu—bao (DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstHospitalofNangAffiliatedto NanjingMedicalUniversity,Nang210006,China) Abstract:ObjectiveToexploretheeffectsofcombiningsalmeterol/fluticasonepropionate(seretide)andrespir- atoryexerciseonpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease(COPD)byanalyzinglungfunction.Methods40 patientswithCOPDwererandomlydividedintotwogroups:experimentalgroup(20cases)andcontrolgroup(20ca- ses).Thebasictreatmentsforthetwogroupswereantibiotics,xygensinhalation,dissipatephlegmandantiasthmaetc. Mterreliefofclinicalsymptoms,thecontrolgroupweregivenseretide;theexperimentalgroupweregivenseretideand respiratoryexercise.Thepatientscandischargefromhospitalwhentheyentirelymasterusageofseretideandmainpoints ofrespiratoryexercise.Allpatientswerecheckedonlungfunctionbeforemakinguseofseretideandrespiratoryexer- cise.Lungfunctionwascheckedafter12weeks,too.Simultaneously,toevaluatetheimprove mentofqualityoflifein twogroups.ResultsBeforetreatment,lungfunctionsinbothgroupswerenotstatisticallydiffe rent(P>0.05).After treatment,therewasimprovementoflungfunctionthanbeforetreatment(尸 <0.05).FEV1,FVC,FEV1/FVCand FEV1%Predweresuperiorinexperimentalgrouptocontrolgroup;Thescoresofqualityoflif eofexperimentalgroupwere lowerthancontrolgroup;Experimentalgroupusedventolinlessthancontrolgroup.Conclusi onCombiningseretide andrespiratoryexercisecanimprovelungfuctionsignificantly. Keywords:chronicobstructivepulmonarydisease;salmeterol/fluticasonepropionate(sere tide);respiratoryexer- cise;lungfunction 肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力 张永臣,许晓殉,赵伟,张亮,赵磊,文剑 (东南大学附属第二医院,江苏南京210003) [摘要]目的:利用肝细胞生长因子(HGF),皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因 子一4(FGF一4)诱导骨髓间充质干细胞 (MSCs)向肝细胞分化,为肝组织工程提供新的细胞来源.方法:取志愿者骨髓,使用 密度梯度离心法联合贴壁筛选法获取 MSCs,用含有HGF,EGF,FGF的培养基进行培养.用流式细胞仪,免疫细胞化学法鉴 定细胞表型,检测诱导后细胞胆红素处理 能力.结果:骨髓MSCs生长良好,表型为CD29阳性,CD34阴性.诱导后细胞可在21 —28d时形成肝样细胞.诱导7d后细 胞检测到AFP的表达,第14天时CK18呈阳性表达,随着诱导时间的延长,阳性率 增加,并能显着降低胆红素浓度. 结论:HGF,EGF,FGF联合能诱导骨髓MSCs分化为具有处理胆红素能力的肝样细 胞. [关键词]骨髓间充质干细胞;肝细胞生长因子;表皮生长因子;成纤维细胞生长因子 一4;胆红素 [中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1671—6264(2009)05—0420—04 肝移植是终末期肝病有效的治疗手段,由于肝源 的缺乏,人工诱导的肝细胞是可供选择的可靠肝细胞 来源;而关于肝干细胞体外分离培养的方法,肝细胞再 生及其在肝脏损伤修复中的作用都尚待进一步研 究?.因此,寻求非肝源性干细胞并促其向肝细胞定 向分化是亟待解决的重要问题.骨髓间充质干细胞 [基金项目]江苏省自然科学基金资助项目(BK2004012) [作者简介]张永臣(1976一),男,江苏南京人,技师,医学硕士.E-mail:zhangyongchen@126.COIll [通讯作者]文剑E—mail:wenjian2400@163.con 张永臣,等.肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力?421? (MSCs)遗传背景稳定,易于体外分离培养,扩增,保持 多向分化潜能,在特定环境下可以分化为肝细胞.这 些研究为寻找非肝源性干细胞提供了新的思路和策 略.同时MSCs免疫原性低,可通过多种途径抑制同 种异体免疫排斥反应,并且克服了使用胚胎干细胞和 胚胎肝细胞治疗的伦理学问题,成为以干细胞为基础 的肝病治疗的更好选择j.Okumoto等体外利用肝 细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF),Lee 等体外用表皮生长因子(epidermalgrowthfactor, EGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor, FGF)诱导人骨髓MSCs分化为成熟样肝细胞.本实 验使用HGF联合EGF和FGF共同诱导人骨髓MSCs 向肝细胞分化,检测骨髓MSCs的分化方向和特征,为 利用骨髓MSCs治疗肝脏疾病提供实验依据. 1材料与方法 1.1材料 DMEM/F12(1:1)培养基购自SAFCBioscience公 司,HGF,EGF,FGF购自Pepro.tech公司,胎牛血清购 自Gibco公司,抗人CK18,AFP,SP试剂盒,DAB试剂 盒均购自北京中杉桥公司. 1.2实验方法 1.2.1骨髓MSCs的分离,培养选取健康志愿者抽 取骨髓5ml,移入含相同体积Percoll淋巴细胞分离液 的离心管上层,2000r?min离心20min,吸取白色 ,加入含有20%胎牛血清的 界面层,PBS冲洗3次 DMEM/F12培养基中,调整细胞数为1×10ml,,分 别接种于25am规格的培养瓶,于37?,5%CO饱 和湿度孵箱内培养,3d后换液,去掉非贴壁细胞,以 后每3d换液1次.纽胞长到80%,90%融合时用 0.25%胰蛋白酶(用1mmol?L,EDTANa:配制)消 化,按1:3的比例接种传代,标记为P1,传代细胞隔日 首次换液,以后每隔3d换液1次,当细胞长到80%, 90%融合时继续传代培养,并标记为P2,依次类推标 记为P3,P4,P5等. 1.2.2骨髓MSCs表面标志的测定取第3代MSCs 1×10.个,加入荧光标记鼠抗人CD29,CD34单克隆 抗体工作液20l,室温孵育30min,PBS洗涤2次,流 式细胞仪检测细胞表面分子. 1.2.3诱导取第3代MSCs接种于6孔培养板上, 按加入含HGF(20g?L),EGF(20txg?L),FGF (10g?L)的DMEM/F12完全培养液培养,定期更 换培养液.在倒置显微镜下观察细胞形态的变化,分 别于培养7,14,21,28d时留取细胞以备检测. 1.2.4免疫细胞化学法染色诱导培养0,7,14,21, 28d时消化诱导细胞制备爬片,PBS冲洗3min,用 95%酒精固定10min,PBS冲洗干净,加过氧化物酶 阻断剂反应10min,PBS冲洗,3min?次,,共3次. 非免疫血清封闭10min,甩弃多余封闭液.加一抗: CK18,AFP,室温反应2h,PBS代替一抗作阴性对照, PBS冲洗,3min?次,,共3次.加生物标记的二抗 10min.过氧化物酶标记的卵白素10min冲洗,DAB 镜下显色,封片,普通光学显微镜下观察,计数500个 细胞. 1.2.5处理胆红素取诱导21d后的肝样细胞和未 诱导的hMSCs分别接种于培养瓶中,加入含胆红素的 培养基进行培养,每天取少许培养上清进行总胆红素 的测定(用Abbott生化分析仪进行). 1.3统计学处理 计量资料用?S表示,使用SPSS10.0统计软件 进行统计学处理,组间比较采用无重复测量的方 差分析,两两比较采用Tukey法. 2结果 2.1骨髓MSCs培养结果及表型特征 细胞大小均匀,呈梭型,长纤维型.原代细胞生长 较缓慢,15,20d铺满整个培养皿底部.传代细胞生 长周期较原代细胞短,1周后细胞生长融合培养皿底 达90%以上.流式细胞仪测定MSCs表面分子显示: CD29阳性率为87.92%,CD34阳性率为6.58%. 2.2诱导细胞的形态学观察 经细胞因子诱导后细胞生长速度较前变慢,细胞在 21,28d时部分细胞形态由长梭形变为三角形,多角形. 2.3免疫细胞化学染色结果 计数染色阳性细胞,计算细胞的阳性染色率发现, 在诱导0d时AFP少量阳性,CK18未见表达.诱导 后第7,14天时AFP高表达,而后持续增强,第2l,28 天表达又减弱;CK18在第7天时弱表达,第14天时 呈阳性表达,随着诱导时间的延长,阳性率增加 (P<0.05).见表1. 表1AFP,CK18在不同时间点的阳性率(?s) Tab1ThepositiverateofAFPandCK18at differenttimepoints(?s1 注:不同时间点两两比较,P<0.05 ? 422?东南大学(医学版)2009年10月,28(5) 2.4处理胆红素结果 未诱导的MSCs无处理胆红素的能力,而诱导21d 后的细胞具有处理胆红素的能力,随着时间的延长胆 红素浓度不断降低,不同天数两两比较,P<0.05 (图1). 图1加入胆红素后不同时间点的胆红素浓度 Fig1TheconcentrationofTBILat differenttimepoints 3讨论 急性肝坏死,重症肝炎,肝癌等肝脏疾病进展快, 很快出现肝衰竭,还有遗传代谢性肝病以及终末期肝 病,临床上原位肝移植无疑是理想的治疗,由于肝 源缺乏,许多患者在等待中死亡.肝组织工程无疑是 帮助患者度过难关的较好方案.肝组织工程研究的首 要任务就是选择可靠的肝细胞来源,并且能够快速地 提供足够的细胞数量. 诱导骨髓MSCs向肝细胞分化主要依赖于一定的 培养条件,因此控制好培养条件就成为体外诱导分化 为肝细胞的关键.HGF,FGF?4在肝细胞的发育和再 生中起着不可替代的作用,目前诱导干细胞向肝细胞 分化的方法以加细胞因子多见?4',主要是分离各种 类群的干细胞,采用HGF进行诱导.HGF可诱导骨 髓MSCs向肝样细胞分化已经被证实,关于EGF一直 以来被认为是一种促有丝分裂因子,具有促进骨髓 MSCs增殖,贴壁生长的作用.HGF的作用贯穿于整 个肝脏的发生,发展及肝再生的过程,因此HGF是体 外诱导骨髓干细胞向肝细胞方向分化的关键性细胞因 子.Oh等通过RT'PCR检测发现,大鼠骨髓细胞中 存在表达AFP和C—met的细胞,进而在体外用HGF诱 导骨髓干细胞分化,在培养细胞中检测到表达ALB的 类肝细胞存在. FGF在肝的再生和发育过程中也有重要的作用, 它们能促进细胞的有丝分裂.Schwaaz等从人,大 鼠,小鼠的骨髓中分离出MSCs的一个亚群建立以 FGF一4和HGF为主的诱导培养体系,发现获得的细胞 不仅具有肝细胞的形态和超微结构,表达AFP,ALB, CK18等肝细胞标志,而且还具有合成糖原,尿素和蛋 白等多种肝细胞的功能. EGF是作用于肝细胞增殖与分化的另一重要细 胞因子,可通过表皮生长因子受体(EGFR)刺激肝细 胞增殖.EGFR可调节EGF和转化生长因子2a (TGF2a)信号,在肝细胞中有高表达,EGF和TGF2ot 是肝细胞潜在的促有丝分裂原,部分肝脏切除后EGF 血浆水平升高2,3倍,EGF/EGFR在肝脏再生早期 阶段有促有丝分裂作用,EGF和HGF都可以诱导形 成肝细胞的基因表达?.徐迎新等?用EGF和 HGF体外诱导小鼠骨髓MSCs,观察细胞形态变为肝 细胞样圆型,免疫荧光染色检测到肝细胞标志物CK18 和白蛋白. 本实验采用常用的密度梯度离心从正常成人骨髓 中分离MSCs,经贴壁培养和换液获得纯度较高的 MSCs,用流式细胞仪检测细胞表面标志表明分离 出的细胞为MSCs.使用HGF联合EGF和FGF共同 诱导人骨髓MSCs向肝细胞分化,检测骨髓MSCs的分 化方向和特征.结果诱导后细胞从形态上具有肝细胞 样形态,免疫组化染色上可见分化后细胞表达肝细胞 标志物CK18和AFP,AFP和CK18均为肝系细胞的特 异性标志,AFP是一种胞浆蛋白,由肝前体细胞分泌, 随着细胞的成熟而消失,成熟肝细胞不表达.CK18 是肝细胞相对特异性的一种角蛋白,在幼稚的肝前体 细胞不表达,当肝细胞趋于成熟或已成熟时表达.同 时诱导后细胞具有处理胆红素的能力,过量的胆红素 可使肝脏的解毒和代谢功能加重,诱导后细胞能清除 胆红素等有害代谢产物维持机体的平衡,说明诱导后 的细胞具有肝细胞的部分功能. 肝细胞是肝脏行使主要生物学功能的最基本单 位.应用培养肝细胞构成的生物人工肝是众多研究者 公认的最有效的形式之一,因为肝细胞型生物人工肝 能最大程度上满足理想人工肝的要求,即参与正常代 谢,清除有害代谢产物,维持机体的水,电解质及各种 激素的平衡.肝细胞型生物人工肝的关键在于肝细胞 的种类,来源和生物反应器的性能即设计的合理性. 目前研究使用的肝细胞主要有人肝细胞,动物肝细胞 和肝源性肿瘤细胞等三大类,其中以人肝细胞最为理 想.由于人肝细胞的来源,培养及贮存尚存在许多向 题,难以达到所要求的数量且使用不方便.通过本研 究,我们认为人骨髓MSCs在体外能用细胞因子分化 为肝细胞样细胞,具有一定的人工肝的支持功能,值得 进一步研究.人骨髓MSCs在体外能用细胞因子分化 为肝细胞样细胞,体外扩增及大规模诱导分化将使骨 1.Iogi懈掣 张永臣,等.肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力?423? 髓MSCs成为体内基因性或获得性肝病治疗及应用于 生物人工肝装置的理想细胞. [参考文献] [1]陆海华,滕皋军.骨髓源性肝干细胞的发现,诱导与移植 [J].东南大学:医学版,2006,25(3):208—211. [2]RYANJM,BARRYFP,MURPHYJM,eta1.Mesenchymal stemcellsavoidallogeneicrejection[J].JInflamm(Lond), 2005,2:8. [3]OKUMOTOK,SAITOT,HATFORIE,eta1.Differentiationof bonemarrowcellsintocellsthatexpressliver—specificgenesin vitro:implicationoftheNotchsignalsindifferentiation[J]. BiochemBiophysResCommun,2003,304(4):691—695. [4]LEEKD,KUOTK,WHANG—PENGJ,eta1./nvitrohepatic differentiationofhumanmesenchymalstemcells[J].Hepatolo— gY,2004,40(6):1275—1284. [5]LAGASSEE,CONNORSH,AL—DHALIMYM,eta1.Purified hematopoieticstemcellscandifferentiateintohepatocytesinvi— vo[J].NatMed,2000,6(11):1229—1234. [6]SCHWARTZRE,REYESM,KOODIEL,eta1.Multipotenta— duhprogenitorcellsfrombonemarrowdifferentiateintofunc— tionalhepatoeyte—likecells[J].JClinInvest,2002,109(10): l29卜l302. [7]SEOMJ,SUHSY,BAEYC.eta1.Differentiation0fhuman adiposestromalcellsintohepaticlineageinvitroandinvivo [J].BiochemBiophysResCommun,2005,328:258—264. [8]OHSH,MIYAZAKIM,KOUCHIH,eta1.Hepatocytegrowth factorinducesdifferentiationofadultratbonemarrowcellsinto hepatocytelineageinvitro[J].BiochemBiophysResCommun, 2000,279:500—504. [9]SKARPENE,OKSVOLDMP,GROSVIKH,eta1.Alteredregu— lationofEGFreceptorsignalingfollowingapartialhepatectomy [J].JCellPhysiol,2005,202(3):707—716. [1O]MICHALOPOULOSGK,BOWENWC,MULEK.eta1.HGF. EGF,anddexamethasoneinducedgeneexpressionpatternsdur— ingformationoftissueinhepaticorganoidcultures[J].Gene Expr,2003,11(2):55—75. [11]徐迎新,王文杰,宋旭华,等.骨髓间充质干细胞定向肝细 胞样分化的研究[J].中华实验外科杂志,2004,21(2): 152-153. [12]袁军,单立冬,杨天明,等.差速贴壁法分离培养早期人胚 骨髓间充质干细胞[J].东南大学:医学版,2005, 24(4):218—221. [收稿日期]2009—02—18 Differentiationofmesenchymalstemcellsintohepatocyte.likecells whichhavebilirubinbiotransformationfunctions ZHANGYong'chen,XUXiao.xun,ZHAOWei,ZHANGLiang,ZHAOLei,WENJian (TheSecondHospitalAffiliatedtoSoutheastUniversity,?ng210003,China) Abstract:ObjectiveToexplorethepossibilityofdifferentiationofmesenchymalstemcells( MSCs)intohepato- cytelikecellsinducedbyhepatocytegrowthfactor(HGF),epidermalgrowthfactor(EGF)an dfibroblastgrowthfactor (FGF),andtofindanewcellsourceforlivertissueengineering.MethodsBonemarrowcellsw ereobtainedfrom volunteers.hMSCswereseparatedbydensitygradientcentrifugationandwereculturedthro ughadhereculture.MSCs wereculturedinDMEM/F12mediumwithHGF,EGF,FGF.Thephenotypesofcellswereidentifiedbyfloweytometry, immunohistochemistry,atlastthehepatoeyte— likecellswereculturedinDMEM/F12mediumwithbilirubin.Results TheMSCs,collectedwereCD29positiveandCD34negative,theMSCsinducedbecamehepatocyte'likecellsandim- munocytochemicalanalysisforCK18andAFPshowedpositivestainingreaction.TheserumconcentrationofTBILin treatmentgroupwassignificantlydecreased(P<0.05).ConclusionHGF,EGFandFGFcaninduceMSCsintohepa- tocytelikecellswhichhavebiotransformationfunctions. Keywords:bonema~owmesenchymalstemcells;hepatocytegrowthfactor;epidermalgrowthfactor;fibroblast growthfaetor一4;bilirubin