[word格式] 2679例羊水细胞培养及染色体核型结果分析

[word格式] 2679例羊水细胞培养及染色体核型结果 2679例羊水细胞培养及染色体核型结果分 析 ? 44?中国优生与遗传杂志2008年第16卷第2期 2679例羊水细胞培养及染色体核型结果分析 郭茗,杨惠珠,陆建英,钟红菱,骆敏,段涛(同济大学附属第一妇婴保健院,上海200040) 摘要:目的探讨羊水细胞培养及染色体核型分析中的若干问,以及穿刺指征对于染色体病产前诊断的意义.方 法对于成功培养的2671羊水标本的染色体结果进行分析,分析检出异常核型的类型,不同穿刺指征的异常检出率以及异 常核型分布的特点.结果与结论2671例成功分析的标本,检出异常核型101例,检出率为3.78%,其中常染色体三体33 例,性染色体三体8例,性染色体单体2例,易位24例,倒位14例,部分缺失4例,嵌合体8例,其他染色体结构异常8 例. 关键词:产前诊断;羊水细胞培养;染色体核型 中图分类号:R714.55文献标识码:A文章编号:1006—9534(2008)02 03 一OO44— 自1966年,Steele和Breg成功培养了羊水中的胎儿细 胞并进行了染色体核型分析至今,羊水细胞培养及染色体核 型分析技术已不断改进,发展,并被广泛应用.虽然,近年来 分子学方法发展迅速,但羊水细胞培养及核型分析仍然是产 前诊断中应用最为广泛,可行,经济的经典方法.我院于上 世纪80年代开展羊水细胞培养及核型分析具有近三十年的 经验.现对1998年本院产前诊断中心成立至今的2679例 羊水细胞培养及染色体核型分析进行回顾性总结. 资料与方法 一 ,资料 1.标本均来自1998年1月到2006年12月前来我院产 前诊断门诊,遗传咨询门诊以及产科高危门诊就诊有医学指 征而无禁忌证之孕妇,接受术前知情告知,成功穿刺2679 例. 2.受检孕妇年龄21,48岁,孕周18,24周. 二,方法 1.采样:在B超监护下,无菌抽取羊水20,30ml. 2.接种:羊水标本离心后弃上清液,将沉淀制成一定浊 度的细胞悬液,接种于AmnioMAX一?完全羊水培养基, 5%CO,37?培养. 3.收获:6天后观察细胞生长情况,换液,当培养瓶中有 6,8个细胞克隆贴壁生长,且细胞克隆中较多圆,折光性强 的分裂细胞时即可收获. 4.制片:经过消化,低渗,固定等步骤,将获得的沉淀制 成细胞悬液,在冰片上制片,每瓶培养物分开制片编号,经过 烤片,G显带,即可分析(必要时加做C显带). 5.分析:每例标本选择形态适中,显带清楚的核型分析 至少3例,计数至少20个核型,如遇异常或有疑问的标本则 需增加分析,计数的例数. 结果 2679例羊水标本中,成功培养2671例,培养失败8例. 培养成功率为99.7%.在成功培养的2671例羊水中,检出 异常核型101例,异常率为3.78%.101例异常核型中21一 三体27例,其他常染色体三体6例,性染色体三体8例,性 染色体单体2例,易位24例,臂内臂问倒位14例,染色体部 分缺失4例,嵌合体8例,其他8例(包括染色体长臂,短臂, 随体,可变区增加等).(见1,表2)在检测出的染色体数 目异常的病例中有3例性染色体数目异常的病例选择继续 妊娠;而在检出的其它类型染色体异常病例中仅1例46, XX/46,XY选择引产,其余病例均选择继续妊娠. 表1受检孕妇穿刺指征及其检出率 }其它包括不良接触史,服药史,不良生活史,本人低智等. 表2检出异常核型分类 }其他包括大Y,小Y,随体增加,可变区增加,mar染色体等. 讨论 新生儿出生缺陷对社会的危害不言而喻,我国每年约有 100万新生儿有出生缺陷,占新生儿5%,其中染色体异常占 出生缺陷的3.6%.羊水细胞培养及染色体核型分析可以在 孕中期对胎儿染色体结构和数目异常作出产前诊断,无疑是 ? 中国优生与遗传杂志2008年第16卷第2期45’ 目前预防胎儿染色体异常最为成熟,有效的方法. 一 ,染色体病产前诊断指征分析l2 1.母血筛查高风险 母血筛查能在较大范围内进行唐氏综合征的风险评估, 因其经济,简便,快速,安全,为大多数孕妇所接受,但因筛查 性质所限,存在一定比例的假阴性,高风险的结果最终需通 过羊水细胞染色体核型分析或者其它三体快速诊断试验来 确诊.从统计结果来看,因母血筛查高风险而前来穿刺的孕 妇是所有接受穿刺的孕妇中比例最高的,占到44.87%,其异 常染色体核型检出率为3.08%.在检出的37例异常核型中 21一三体9例,18一三体2例,47,XXX和47,XXY各1例, 45,XO1例,以及7例平衡易位.可以看出母血筛查阳性结 果不仅提示21一三体高风险的可能,对其他染色体三体风险 也有所提示作用.此外,还有研究发现,筛查的阳性结果不 仅提示染色体数目异常的高风险,还可能涉及染色体结构异 常,甚至更为复杂的基因结构上的异常J.由此可见,染色 体核型分析与其它快速诊断相比,不仅能在染色体数目上加 以诊断,其优势则是能对染色体的结构异常作出明确的诊 断l4J,当然对于复杂的基因结构异常则需进一步用分子方法 来诊断.’ 2.高龄孕妇 高龄孕妇是位居第二的穿刺指征,在前来穿刺的孕妇中 占到29.90%.孕妇年龄和染色体病发病率有一定的关系, 一 般当孕妇年龄超过35周岁,生育年龄与胎儿染色体异常 之间则出现较非高龄更为密切的关系,其中以染色体三体的 异常居多.在2679例穿刺病例中,因单纯高龄前来穿刺的孕 妇中就发现了多例21一三体,47,XXY和47,XXX.此外,也 有资料表明同样存在父亲的年龄效应,当胎儿的父亲年龄超 过55岁时效应将更为明显J. 3.染色体异常的孕产史 曾生育唐氏儿的孕妇年龄在25岁以下,再发风险可增 加50倍.我院曾发现一例连续三次普通型21一三体妊娠史 病例,以及多例连续两次染色体三体妊娠史的病例. 4.超声显示胎儿异常 胎儿染色体异常可引起多种胎儿肢体或器官的畸形,这 种畸形最早可能是通过超声检查发现.因超声显示异常前 来穿刺孕妇中染色体异常的检出率高达14.29%,其中以染 色体数目异常居多.胎儿多发畸形,脉络膜囊肿,脐血流异 常,颈项透明层(NT)增厚多发畸形等都提示可能有染色体 方面的异常.尤其是孕早期的NT厚度筛查唐氏综合征目前 广泛应用于临床,NT厚度,PAPP—A和母血游离13hCG三项 指标联合筛查,对孕早期21一三体的识别率更是达到了 85%,90%【. 5.夫妇一方为染色体异常的携带者 具有这种病史的孕妇,胎儿染色体异常的检出率最高, 为86.67%.染色体异常的携带者往往在临床表现上很难发 现,通常是由于女方反复流产或出现染色体异常孕产史后检 查染色体时才发现.其中,最需要重视的是易位型21一 三体携带者,这类携带者最易生育易位型21一三体胎儿,必 须在孕中期进行羊水细胞染色体检查,以排除胎儿易位型2l 一 三体的可能. 6.不良孕产史 二,羊水细胞生长情况分析 要作出高质量的染色体核型分析,首先要取得一定数 量,数目完整,结构清晰的染色体,其关键则是要培养出足够 数量的制备染色体所需要的细胞.对于培养后贴壁生长细 胞的识别以及收获时间的判断,都是制备染色体的关键.经 过6,7天的培养后,基本有两种细胞群贴壁生长:成纤维细 胞和上皮样细胞,此外还可以看到正处于分裂的圆球形细 胞引. 1.成纤维样细胞(F细胞):在形态,细胞克隆密度和生 长潜能上相似于皮肤成纤维细胞,此类细胞适时收获能够取 得染色体标本. 2.密集上皮细胞:此类细胞呈三角形,多角形,椭圆形, 细胞间紧密相接,细胞克隆呈一明显界线,生长缓慢,圆球形 细胞少,能收到分裂细胞但频率不高. 3.镰刀形上皮细胞:当培养基中含有毒性物质或不良 培养基时会出现此类细胞,这种情况难以取得满意的染色 体. 4.羊水样细胞(AF细胞):形态介于成纤维细胞和上皮 细胞,呈多角形,排列不整齐,胞质呈放射状突出.细胞克隆 外形,生长潜能和上皮细胞相似.此类细胞适时收获能获得 令人满意的结果. 收获细胞的时机对于取得满意的染色体核型同样重要, 确定收获的依据有以下两点:第一,培养瓶中有4,6个较大 的细胞克隆:第二,细胞克隆中的存在发亮球形分裂细胞,一 个高倍视野中有10,15个,有时可见分裂细胞两两相连. 三,嵌合体分析 在染色体核型分析过程中会出现一种特殊的情况—嵌 合体.在检出的101例异常核型中就有8例嵌合体,占检出 异常核型7.92%.检出的8例嵌合体具体核型也较为复杂, 有正常数目和异常数目的嵌合,有异常数目之间的嵌合,也 有正常结构和结构异常的嵌合.嵌合体的真假判断有一定 难度.对于采用原位培养的标本可较好区别真假嵌合体,因 为在体外培养下产生的某种畸变可能只限于一个细胞克隆, 如果在多个克隆中都有同一种异常,那这种异常可能不是体 外培养而引起的畸变,而是真正的异常.本实验室采用传统 的方法培养羊水细胞而非原位培养,在用胰酶消化收获过程 中不同培养瓶独立收获,制片,如果异常都来源于同一培养 瓶则可以考虑是体外培养畸变;如果来源于不同培养瓶则可 考虑是细胞本身异常.在操作上,我们首先弃去最初抽取的 2ml羊水,以使母体污染的可能性降到最低;同一标本分多个 培养瓶培养;配合高质量的分带,染色,最大可能的减少假嵌 合体的出现.对于发现嵌合体的情况则建议孕妇复抽羊水 或抽取脐带血复核,并做好遗传咨询工作,告知嵌合情况的 复杂性和危险性,涉及性染色体嵌合的病例则需随访至青春 期. 对于染色体病的产前诊断,除了明确的穿刺指征,高质 量的细胞培养,分析技术之外,还需配合以专业的遗传咨询, 完整的家系调查和系统的随访工作J.异常的染色体结果 往往需要配合家系调查才能够给孕妇一个更为合理的临床 (下转第33页) 中国优生与遗传杂志2008年第16卷第2期?33? 对口服BH4有反应,几乎70%的血Phe浓度在400, 800txmol/L的HPA患儿对口服BH4(20mg/kg)有反应J,即 BH4负荷试验24h血Phe浓度较负荷前0h血Phe浓度下降幅 度大于30%,但未能降至正常范围.此部分患儿被诊断为四 氢生物喋呤反应性PAH缺乏症.本研究的51例患儿中有10 例诊断为BH4反应性PAH缺乏症,9例患儿血Phe浓度在 360,1200tunol/L之间,1例>1200panol/L.17例中度PKU 患儿中,9例(52.9%)对BH4有反应,支持国外的研究结果. 此部分患儿可以通过口服BH4治疗而替代以往的低苯丙氨酸 饮食治疗,提供了一种简单,方便,有效的新的治疗途径. 本研究从51例患儿中共鉴别出5例BH4缺乏症,检出 率为9.8%,表现为尿生物喋呤显着降低,新喋呤显着增加, 血红细胞DHPR活性正常,血Phe浓度在BH4负荷后4h内 降至正常,即全部诊断为6一丙酮酰四氢喋呤合成酶(6一 pyruvoyhetrahydropterinsyuthase,PTPS)缺乏症.他们需要 BH4,左旋多巴,五羟色胺三药联合治疗,才能阻止严重的神 经系统损害症状产生.9.8%的检出率高于中国北方人群 3.6%BH4缺乏症的发病率J. 本研究的51例患儿血酪氨酸浓度低于正常范围,说明 他们肝脏内由于缺乏PAH或PAH辅酶,而不能将血中苯丙 氨酸转变为酪氨酸,致使血中酪氨酸水平下降. 随着新生儿筛查在全国范围内逐步推广,HPA检出率明 显提高,因此应尽快作出HPA各种类型的鉴别诊断,使患儿 在早期得到及时治疗,早诊断早治疗对HPA的预后有着非 常重要的影响.BH4负荷试验既安全又可靠,准确度高,可 以在能精确测定血苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)浓度的医 院应用. 参考文献 [1]BerneggerC,BlauN.Highfrequencyoftetrahydrobiopterin—respon— sivenessamonghyperphenylalaninemias:astudy0f1919patientsob- servedfrom1988to2002[J].MelGenetMetab,2002,77:304—313. 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