琥珀酸脱氢酶的纯化研究

琥珀酸脱氢酶的纯化研究 ()2000 年 12 月D ec. 2000 河北师范大学学报 自然科学版 ()Jo u rna l o f H ebe i N o rm a l U n ive r sity N a tu ra l sc ience 第 24 卷 第 4 期 V o l. 24 N o. 4 Ξ 琥珀酸脱氢酶的纯化研究 夏玉凤,孙新立,冯小燕, 王友爱 ( )河北师范大学 生命科学学院, 河北 石家庄 050016 摘 要: 以 玉 米 黄 化 苗 为 生 物 材 料, 将 其 捣 碎 后, 通 过 差 速 离 心 获 得 线 粒 体, 使 用 超 声 波 将 其 破 碎, 用 2% 2100 溶膜, 超速离心, 硫酸铵沉淀, 2层析纯化琥珀酸脱氢酶, 纯化倍数为 12 倍. 电泳图谱显示一 T r ito n X D EA E C 32 条带. 关键词: 琥珀酸脱氢酶; 纯化; 玉米 () 文章编号: 100025854 20000420519202 中图分类号: 554. 5 文献标识码: Q A () 琥珀酸脱氢酶 , 简称 是线粒体内膜的结合酶, 是连接 [ 1. 3. 99. 1 Su cc in a te deh yd ro gen a seSD H EC 氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一. 其作用是催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸, 把氢交给 进入电子传 , FA D 递链. 琥珀酸脱氢酶属膜结合酶, 位于线粒体内膜. 离开膜后, 暴露在空气中会很快失活, 提纯难度较大. 1 从植物中提纯 的例子为数较少, 仅在甘薯根部、烟草叶子、菜豆根等植物材料中部分提纯了 SD H 目前对 的分子组成还有争议. 为了搞清其组成, 首先要搞提纯, 因此我们做了一些工作, 力求提 . SD HSD H 纯 .SD H 1 实验部分 1. 1 试剂 植物 由本室武淑萍老师提供; 购自华美公司; 由德国进口; , 购自, C aM N A D K B SA PM SF PM ST r is 公司; 其余为国产分析纯.Se rva 1. 2 材料与方法 1. 2. 1 的纯化参照文献 1, 2 , 有修改. 本实验采用玉米黄化苗, 线粒体膜碎片的制备参照文献SD H 1 , 有修改. 用 2% 2100 溶解线粒体膜碎片, 游离 处理 30, 不断搅拌. 之后 105 超速冷冻离 , T r ito n X SD H m in k g () 心 1 . 上清液用饱和硫铵 事先用铵水调 处理至 30% 饱和度, 轻轻搅拌 30, 1. 5 万 ƒ离心8. 0hpH m in rm in 20; 上清液再用饱和硫铵处理至终浓度 50% 饱和度, 处理 1 后, 1. 5 万 离心 20, 取沉淀. 将 ƒm inh rm in m in ( )( 沉 淀 用 10重 溶, 透 析 4 透 析 液 为 ? 重 蒸 水 = 1 ? 9 . 样 品 上 2柱 用mL B u ffe rA h B u ffe rA D EA E C 32 ) 平衡, 以 淋 洗 50, 换 用 含 有 0, 0. 3ƒ的 及 0. 11% 的 2100 的B u ffe rA B u ffe rA mL m o lL N aC l T r ito n X 梯度洗脱, 用部分收集器收集, 活性部分即 保存备用., B u ffe r B SD H 1. 2. 2 活 力 测 定 参 照 文 献 3 ,有 修 改.反 应 液 为 10ƒ100 ƒ琥 珀 酸 钠, 200 mm o lL C aC l2 ΛL mm o lL () ( ) (100 ΛL , 500mm o lƒL 磷酸钾 100 ΛL pH 7. 4, 10 gƒL N B T 氮兰四唑100 ΛL , 60mm o lƒL T r is2H C l pH ) 7. 8500 加入酶液 100 臵 37 ?预保温 5, 加入 3 ƒ混匀, 37 ?保温 30. 之后 , , 40 , ΛL ΛL m in gL PM S ΛL m in加入 110% 终止反应, 加 3异丙醇, 混匀, 于 548 测 值.mL T CA mL nm OD 对照: 除不加底物琥珀酸钠外, 其余药剂及酶液均加入, 反应终止后, 回加底物琥珀酸钠, 于 548 测nm 值.OD 规定: 30内 548 下 值为 1. 0 时的酶量为 1 个活力单位.m in nm OD 比活力= 活力单位数ƒ毫克蛋白. Ξ 收稿日期: 1999 03 06; 修回日期: 1999 10 12 ( )基金项目: 国家自然科学基金资助项目 39570072 ( ) 作者简介: 夏玉凤 1972 , 女, 河北藁城人, 河北师范大学硕士研究生. 1. 2. 3 参照 系统.PA GE L aemm li 2 结果 2. 1 使用阴离子交换柱分离纯化 SD H 将透析后的样品上柱, 由于 等SD H 电点偏酸, 因此先用 的磷酸缓冲7. 4 pH 液淋洗 50后, 换用 的磷酸缓6. 8 mL pH ( 冲液进行梯度洗脱 梯度为 0N aC l N aC l ), 0.3m o lƒL . 洗脱情况见图 1. 图 1 表 明, 在 0.08, 0.10ƒ梯SD H m o lL N aC l 度范围洗脱下来, 而且酶活力较高. 2. 2 不同步骤提纯 SD H 各种不同步骤提纯 情况见表SD H 1. 由表 1 可见, 经过各步提纯, 酶的比活 力、提纯倍数都有所上升, 经过每步 提 纯, 酶 都 得 到 一 定 的 纯 化.经 T r ito n 溶膜后, 回收率达到 79. 53% , 而溶膜前 图 1 玉米线粒体 SD H 的 D EA E-C纤维素柱离子交换层析 32 为 66. 37%. 这可能是由于 溶膜T r ito n 后, 更好地维持了酶的空间构象, 表现出较高的酶活力. 最终, 将酶提纯 12 倍. 过 2后, 酶 样 的 电 泳 情 况 见 D EA E C 32 表 1 玉米黄化苗线粒体琥珀酸脱氢酶的提纯 图 2. 由图 2 可见, 电泳图谱只显示了一条谱 总蛋白总活力比活力提纯回收率 纯化步骤 - 1 带, 说明 SD H 的纯化已达到电泳纯. ()ƒƒ ? 倍数 % ƒƒm g u um g 超声波处理 402. 00 565. 20 1. 41 1. 00 100. 00 后的线粒体 亚线粒体膜 179. 80 375. 10 2. 08 1. 48 66. 37 碎片 2% 处 T r ito n 理后超离心 145. 70 449. 50 3. 09 2. 19 79. 53 图 2 的天然电泳图谱 SD H 30%, 50% 3 讨 论 硫铵沉淀 14. 56 108. 16 7. 30 5. 27 17. 14 属膜结合酶, 离开膜后易失活.SD H 为 2D EA E C 32 了成功地将其从膜上溶解下来, 既溶下一定所得的酶 1. 01 16. 75 16. 80 11. 92 2. 97 的酶量, 又保持相当的活性, 就要求选择适当 的溶膜剂. 我们尝试了多种溶膜剂, 如脱氧胆酸钠、吐温、等. 其中脱氧胆酸钠只能溶下不到 13 的ƒT r ito n 酶, 吐温溶膜效果也不理想. 而 可溶下大部分酶, 且活力保持较好, 因此最终选择了 .T r ito n T r ito n 由于 是膜结合酶, 在过 2时, 洗脱液中加入 0. 1% , 对保持酶活性是有好处的. 另 SD H D EA E C 32 T r ito n 外, 由于 对 活力有抑制作用, 因此洗脱时避免用 我们选择了磷酸缓冲液., T r is SD H T r is SD H 是一种氧化还原酶, 提取过程中尽量注意隔氧, 低温操作. 提纯后, 酶液放在甘油中低温保存. 参考文献: 1 T SU KA HO H a t to r i, TA DA SH I A sah i. T h e p re sence o f tw o fo rm s o f succ ina te deh yd ro gena se in sw ee t po ta to roo t () [. , 1982, 23 3: 5152523.m ito cho nd r ia J P lan t C e ll P h y sio l 2 第 2 版. 北京: 高等教育出版社, 1990. 2992304. 张志良. 植物生理学实验指导 [M . 2+ , . 223 IKU KO E zaw aE T SU RO O ga taC aInduced ac t iva t io n o f succ ina te deh yd ro gena se and th e regu la t io n o f m ito cho 274.[. , 1979, 85: 64nd r ia l o x ida t ive reac t io n s J B io ch em () 下转第 532 页 ()第 24 卷532 河北师范大学学报 自然科学版 表 2 反应时间对反应的影响 表 3 氧化亚铜用量对反应的影响 序号产率%产率%ƒƒ反应时间ƒh 产量ƒg 序号 氯化亚铜用量ƒg 产量ƒg 1 6. 5 26. 2 83. 1 1 2. 5 26. 3 83. 1 2 7. 0 26. 4 83. 8 2 3. 5 27. 5 87. 0 3 7. 5 27. 5 87. 0 3 4. 0 27. 5 87. 0 4 8. 0 27. 3 86. 7 3 讨 论 () 1以硝基苯代替工业常用的三氯苯溶剂. 硝基苯比三氯苯具有易得、价廉优势. 同时对硝基苯用量加 以摸索, 既避免了用量少导致产率低, 又避免了用量太多, 会对人体造成危害的缺点. 故该法是一种有益的 探索和改进. () 2该法没使用 等物质, 具有成本低、精制容易、操作简化的优点., N H 4C IN H 4 I 参考文献: 1 A KAM A T SU T ak a sh i, KUW A HA RA Yuk io. M anufac tu re o f copp e r p h th a lo cyan ine [J . Jp n Ko k k yo Ko ho , 1979. 2 . [. , 1969,SA D TL ERS tanda rd inf ra red g ra t ing sp ec t ra o f copp e r p h th a lo cyan ine J S tanda rd Inf ra red G ra t ing Sp ec t ra 9: 8 543. Im provem en t of the Syn the t ic M e thod f or P igm en t Copper Ph tha locyan in e 22, L I X u ep in gQ IN M e isu (), 050017, H ebe i M ed ica l U n ive r sitySh ijiazh uang C h ina , : , . A bstra c tU se p h th a lic an h yd r ideU rea an d C u 2C l2 a s reac to rW ith so lven t p hN O 2 in stead o f u su a l , , C 6H 3C l3 it g ive s m o re copp e r p h th a lo cyan in e b y ch an g in g vo lum e o f so lvm en tw e igh t o f C u 2C l2 an d t im e .o f reac t io n th an b efo re Key word s: p igm en t copp e r p h th a lo cyan in e; n it ro b en zen e; im p ro vem en t o f th e syn th e t ic m e tho d () 责任编辑 柴 键 ()上接第 520 页 Pur if ica t ion of Zea SD H 2222, , , X IA Y u fen gSU N X in liF EN G X iao yan W A N G Yo u a i (), , 050016, Co llege o f L ife Sc ienceH ebe i N o rm a l U n ive r sitySh ijiazh uang C h ina : A bstra c tSu cc in a te deh yd ro gen a se is p a r t ia lly p u r if ied f rom zea e t io la ted seed lin g t issu e b y , , d iffe ren t ia l cen t r ifu ga t io n so n ic o sc illa t io n so lu b iliza t io n o f th e en zym e f rom th e su bm ito cho n d r ia l 2100, 2. p a r t ic le s w ith T r ito n X amm o n ium su lfa te f rac t io n a t io n an d D EA E C 32 ch rom a to g rap h yT h ro u gh , .PA GE o n e m a jo r b an d is de tec ted o n ge l : ; ; Key word ssu cc in a te deh yd ro gen a sezeap u r if ica t io n () 责任编辑 柴 键