荧光分光光度法检测组织中的组胺

荧光分光光度法检测组织中的组胺 荧光分光光度法检测组织中的组胺 第36卷第2期第275页 2007年4月 华中科技大学(医学版) ActaMedUnivSciTechnolHuazhong Vo1.36No.2P.275 Apr.2007 荧光分光光度法检测组织中的组胺* 何功浩周四元胡静孟静茹王慧罗晓星? 第四军医大学药学系药理学教研室,西安710032 摘要目的建立组织中释放组胺的检测方法.方法采用邻苯二甲醛(OPA)对组织中释放的组胺(HA)进行衍 生,对衍生物进行激发与发射波长扫描.采用Na.PO沉淀组织液中的干扰离子.结果组胺一邻苯二甲醛衍生物的最 大激发波长和发射波长分别为347am和442am,Na.PO能够有效地消除Ca抖和Mg对荧光的淬灭作用.该法测定 组胺的工作曲线回归方程为F一1.584C+4O.392,相关系数r一0.9995,线性范围为9.01×10,9.01×10mol/L, 检出限为4.51×10mol/L.高,中,低浓度组胺的回收率为91.9,115.8.结论该方法可用于检测组织中释放 的组胺,无须提取,操作简便,快捷,效果可靠. 关键词荧光分光光度法;组胺;邻苯二甲醛 中图法分类号R917 DeterminationofHistamineinTissuesbyFluorometricMethod HeGonghao,ZhouSiyuan,HuJingetal DepartmentofPharmacology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032 AbstractObjectiveToestablishamethodtOdetecthistamine(HA)releasedfromtissues.Met hodsC卜Dhthalaldehvde (OPA)wasusedtOderivatizeHAreleasedfromtissues.Excitationandemissionscanwereper formedonthereactionsystem. NaPO4wasusedtOprecipitateCaandMg.ResultsTheexcitationmaximaandemissionmaxi mawere347nmand442 am,respectively.NaP04coulddiminishtheeffectofCaandMgonthefluorescenceintensityo fthereactionsystem.The workingcurveforHAwasF一1.584C+40.392withthelinearrangeof9.01×1O一一9.O1×10一mol/Landwithcorrelation coefficientof0.9995.Thedetectionlimitwas4.51×10mol/L.Therecoverywasbetween91.9一115.8.ConclusionThis methodcanbeemployedtOdetectHAreleasedfromtissueswithoutextractionofHAfromthe sampleandiSeasytOoperate. Keywordsfluorometry;histamine;O-phthaIaIdehyde 组胺(HA)是机体内具有强生物活性的物质之 一 ,在中枢神经系统,HA作为神经递质介导觉醒和 睡眠,认知和记忆等作用;在外周组织中,HA主要 介导过敏反应及促进胃酸分泌.在心肌缺血情况 下,大量HA释放还可导致严重心律失常.近年来 有报道表明HA可能作为一种新的外周交感神经 递质而参与调控心血管功能活动_1].因此准确而 快速地测定外周神经释放HA,对于阐明神经性 HA的生理和病理意义十分重要. 目前检测生物样品中组胺常用的方法有高效液 相色谱法l_3],酶联免疫法_6等.其中,高效液相色 谱法灵敏度较高,但仪器及耗材较为昂贵,且其前处 理步骤比较繁琐,需要经过提取后才可衍生进样,提 取步骤相对复杂;酶联免疫法测定虽然步骤简便,但 检测灵敏度较低.组织中释放HA的量很低,建立 国家自然科学基金资助项目(No.30300104) 何功浩,男,1980年生,硕士研究生,助教 ?通讯作者,Corresp0ndingauthor,Tel:029—84774591,E—mail:XX luo3@fmmu.edu.cn 操作简便,灵敏度高的检测方法尤为必要.HA本 身无荧光,但与邻苯二甲醛(OPA)的缩合产物可发 荧光.本研究探索了组织液中各离子成分对于 HA—OPA反应体系荧光强度的影响,建立了一种简 便,灵敏,快速的组胺检测方法. 1材料与方法 1.1药物与试剂 组胺二盐酸盐(HA)(AR,美国Sigma公司); OPA(AR,国药集团化学试剂有限公司);甲醇 (AR,西安化学试剂厂).其他试剂均为纯.所 用水均为Millipore去离子水. 1.2仪器与动物 F一2500荧光分光光度计(日本日立公司);XF一3 型电生理刺激器(上海医用电子仪器厂).雄性SD 大鼠,180,200g;雄性豚鼠,300,400g;雄性小 鼠,3O,40g. I.3衍生化方法 配制9.01×lOmol/LHA标准溶液,取1ml ? 276?华中科技大学(医学版)2007年4月第36卷第2期 HA,加0.1mol/LHC11ml,然后加入0.4mol/L NaOH溶液0.5ml,混匀后立即加入0.1OPA甲 醇溶液0.1ml,混匀置室温下反应10min,加0.5 ml0.5mol/LHCI终止反应.所得反应产物置于 荧光分光光度计中进行激发和发射波长扫描. 1.4各离子对产物荧光强度影响 检测的组织样本为Krebs液,其中含有NaC1, KC1,KH2PO4,NaHCO3,CaC12,MgC12和葡萄糖 (Glu)等多种成分.具体配方为:NaC10.15mol/ L,KC14.6N10,mol/L,MgC121.2×10,mol/L, KH2PO41.2×10..mol/L,NaHCO32.48×10一 mol/L,CaC122.5N10_.mol/L,Glu5.6N10一. mol/L.为考察其中各离子对于衍生化产物荧光强 度的影响,配制6组溶液,分别为:?只含NaCI;? 含NaC1,KC1,KH2PO和Glu;?含NaC1,KC1, KH2PO,Glu和NaHCO3;?只含CaC12;?只含 MgC12;?含CaC12和MgC1,各成分浓度与Krebs 液相应成分相同,并用其分别配成HA的标准溶液 (HA浓度均为9.01×10一tool/L).各取1ml进 行缩合反应,分别测定其荧光强度. 1.5待测样本收集 电场刺激啮齿类动物离体输精管是研究交感神 经递质释放及功能的常用模型【7],本研究利用前述 HA检测方法观察电场刺激交感神经末梢对大鼠, 豚鼠或小鼠离体输精管标本释放HA的影响.将 大鼠,豚鼠或小鼠分别脱颈处死,迅速取输精管,清 除周围脂肪,血管及结缔组织,置于灌有5mlKrebs 液的恒温浴槽内,温度37?,液体中始终通有95 02+5CO混合气体.输精管一端固定于浴槽底 部,另一端以丝线悬于张力换能器上,调整组织初始 张力为9.8N10,N,平衡1h,小鼠输精管初始张 力调整为4.9N10一N.其间每10分钟更换1次 灌流液,每次均为5ml.输精管两侧置1对平行金 属板电极,电极连于电生理刺激器上,以备电场刺激 之用.平衡完毕后给予频率为25Hz,波宽1ms的 电场刺激,刺激时间为60S.刺激完毕立即吸取灌 流Krebs液1ml,以Na.PO预处理后按"1.3"所述 方法进行荧光测定. 2结果 2.1产物的荧光光谱特征 HA本身不具有荧光特性,但在碱性条件下与 OPA发生缩合反应后生成具有较强荧光特性的产 物,产物在酸性条件下稳定.该缩合产物的荧光光 谱如图1所示,其最大激发波长和发射波长分别为 l0000 8000 曼60oO 靛4000 2000 O EX:激发波长扫描;EM:发射波长扫描 图1HA与OPA缩合产物的荧光光谱(HA的浓 度为9.01×10tool/L) 2.2组织中金属离子对于产物荧光强度的影响 由图2可见,Krebs液中Ca和Mg对于体 系荧光强度有着很大的抑制作用,在Ca和Mg 单独或者同时存在的情况下,体系荧光强度较无 Ca.和Mg时下降(77.2?1.97)(一4),仅较 空白本底略高.加入Na.PO时可使产物体系荧光 强度增强(图3).NaHCO.对于产物体系荧光强度 亦有抑制作用,原因可能与NaHCO.影响产物体系 PH值有关. 鳗 靛 罂 1:只含NaC1;2:含NaC1,KC1,KH2PO4和Glu;3:含 NaCI,KC1,KH2PO4,Glu乖NaHCO3;4:只含CaC12;5: 只含MgC12;6:含CaC12和MgC12;7:空白本底(不含 HA) 除7外其余各组溶液HA浓度均为9.O1×10mol/L, 溶液各离子浓度与Krebs液相应成分相同 图2组织样品中不同离子对反应体系荧光强度的影响 2.3干扰离子的隐蔽 加入不同浓度Na.PO对于反应体系荧光强度 何功浩等.荧光分光光度法检测组织中的组胺?277? 2 l 氍 - 靛 波长(nn1) 1:Na3P0前处理(HA浓度为9.01×10mol/ L);2:无Na.PO处理,其余溶液成分均与1相同 (HA浓度为9.01×10mol/L) 图3Na.PO对于反应体系荧光强度的影响 的影响如图4所示,可见Na.PO可有效去除干扰. Na.PO浓度不同,同样浓度HA(9.01×10mol/ L)所得荧光强度不同.当Na.PO浓度达到0.7 mol/L时,荧光强度达到最高. 2.4工作曲线回归方程和检出限 在9.01×10,9.01×10mol/L范围内, HA的浓度与荧光强度之间有着良好的线性关系, 见图5.检测HA的工作曲线回归方程为F一 1.584C+40.392(C:×10一mol/L),相关系数r一 0.9995,检出限为4.51×10,mol/L. 2.5分析方法的准确度 采用回收实验检验本方法的准确度,配制低, 高浓度HA(18.02×10,,360.40×10,,720.80× 10mol/L)分别衍生测定荧光强度,结果见表1. 回收率范围在91.9O,115.80之间,表明该方 法稳定可靠. 2500 2000 骥1500 盔1000 500 0 NaPO,(mol/L) 图4不同浓度Na.PO对于反应体系荧光强度的 影响(n----5,HA浓度为9.01×10mol/L) l6oo l400 l200 l000 憩800 表600 蕾400 200 0 400600800l000 HA(X10一ol/L) 图5HA浓度与荧光强度的回归曲线 (r=0.9995) 表1检测HA的回收率及精密度实验结果 2.6样本分析 按照前述方法收集到离体输精管电场刺激后的 灌流Krebs液进行样品分析,沉淀处理后测定其荧 光值,得到灌流液中HA浓度为:大鼠,(7.22× 10一4-_ 9.72×10.)tool/(L?g)(一6);豚鼠, (1.16×10一?1.09×10一.)tool/(L?g)(一5); /J,鼠,(1.03×10一?3.08×10一)tool/(L?g)( 一3) 3讨论 本实验室前期研究工作表明,HA可能作为一 种新的外周交感神经递质u.因此迅速而灵敏地 检测神经源性HA的释放量有着重要的意义.本 法耗时短,操作简便,整个衍生过程只需10min,同 时具备一定的灵敏度.将本法用于检测前述不同种 属离体组织标本能很好检测其神经源性HA的释 放. 在本实验过程中发现,组织液中的HA与OPA 发生衍生反应后,产物荧光强度较弱,不足以达到所 需的灵敏度.分析了Krebs液中各离子对反应体 系荧光强度的影响,发现Ca和Mg对于衍生产 物体系荧光强度有很强的抑制作用,而将Ca抖和 Mg沉淀后,可使反应产物体系的荧光强度极大增 强,从而提高了方法的灵敏度.此方法对于临床及 实验研究中HA的荧光检测有一定的指导意义. ' 278?华中科技大学(医学版)2007年4月第36卷第2期 但是,对于Ca抖和Mg淬灭体系荧光的机制尚有 待进一步探讨. 考虑到Ca计和Mg的磷酸盐属难溶物,且 Na.PO对于体系pH值影响较小,PO离子较为 稳定,故选用Na.PO作为沉淀剂.在对Na.PO条 件进行优化时,观察到当Na.PO浓度达到0.7 mol/L时,反应体系的荧光强度达到最高,但其相应 空白本底也较高,其信噪比相对于加入0.5mol/L Na.PO时反而减小,因此,本方法中加入的Na.PO 浓度定为0.5mol/L.本实验曾考虑使用Na.CO. 作为沉淀剂,但NaCO.对于产物体系pH值有一定 影响,且Na.CO.与体系中HC1反应可产生气泡,会 干扰荧光检测. 将本检测方法用于离体标本的HA测定,结果 表明,大鼠,豚鼠或小鼠输精管交感神经末梢受电场 刺激后均能释放HA.其中,豚鼠单位质量标本释 放HA最多,大鼠最少. 综上所述,本实验建立了以Na.PO沉淀后直 接衍生测定组织中HA的方法,并将其用于离体生 物标本HA释放量的测定.该方法无须提取,灵敏 度较高,具有简便,快捷,易于操作的特点. [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 参考文献 IIMK,IU()XX,CHENI.eta1.Co—localizationofhista— mineanddopamine-beta—hydroxylaseinsympatheticganglion andreleaseofhistaminefromcardiacsympatheticterminalsof guinea—pig[J].AutonAutacoidPharmacol,2003,23(5/6): 327—333. IIMK,HUJ,CHENZ,eta1.Evidenceforhistamineasa neurotransmitterinthecardiacsympatheticnervoussystem [J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2006,291(1):H45一 H51. 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(2006—12一O5收稿) ? 期刊文摘?轴突导向因子netrin—l在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其与 胎盘新生血管形成的关系 [杨昀,邹丽,徐可树.中华妇产科杂志,2006,41(9):597,600] 探讨轴突导向因子netrin一1在子嫡前期孕妇胎盘组织中的表达及其对胎盘新生血管形成的作用.采用RT—PCR和免疫 印迹技术,分别检测正常妊娠妇女2O例(正常妊娠组)和子痫前期孕妇2O例(子痫前期组,其中轻度12例,重度8例)的胎盘 组织中轴突导向因子netrin一1mRNA和蛋白的表达;采用免疫组化并通过抗F8因子抗体检测两组孕妇胎盘组织中的血管密 度.结果,(1)正常妊娠组及子痫前期组孕妇胎盘组织中netrin一1mRNA相对吸光度(A)值分别为(0.51?0.08)和(0.41? 0.06),netrin一1蛋白A值分别为(26.4?1.8)和(20.5?1.3),两组分别比较,差异有统计学意义(P<0.01).子痫前期组轻度 和重度孕妇netrin一1mRNAA值分别为(0.48?0.08)和(0.344-_0.07),netrin-1蛋白A值分别为(22.8?1.3)和(18.2? 1.O),两者分别比较,差异有统计学意义(P<0.01).(2)子痫前期组孕妇胎盘血管密度为(54?8)个,正常妊娠组孕妇为(65 ?10)个,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01);子痫前期组中重度孕妇血管密度为(48?7)个,轻度孕妇为(60?9)个,两 者比较,差异有统计学意义(P<0.01).(3)正常妊娠组孕妇胎盘组织中netrin一1mRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相关 关系,相关系数(r)分别为0.67和0.71(P均<O.01);子痫前期组孕妇胎盘组织中netrin一1mRNA及其蛋白表达与血管密度 呈正相关关系,r分别为0.61和0.70(P均<O.01);子痫前期组轻度孕妇胎盘组织中netrin-1mRNA及其蛋白表达与血管密 度呈正相关关系,r分别为0.69和0.73(P均<O.01),重度孕妇胎盘组织中 netrin-1mRNA及其蛋白表达与血管密度呈正相 关关系,r分别为0.71和0.75(P均<O.01).提示子痫前期孕妇胎盘组织中netrin一1表达下降,可能是胎盘血管密度降低的原 因之一.