人类染色体显微切割,PCR,微克隆技术及其应用

人类染色体显微切割,PCR,微克隆技术及其应用 人类染色体显微切割,PCR,微克隆技术及其 应用 ff)\7口\BU【I(弹锯慧黼uNIv.1998?23(2) 9,(, f一胛人类染色体显微切割,PCR,微克隆 技术及其应用 黄蕾阮庆国和平徐磊邓汉湘夏家辉 (置学遗传学国京重点宴验室长410078) /, 置置切割 中田田分类号Q343 染色体显徽切割,PCR,徽克隆技术是细胞遗传学 与分子遗传学相结合的产物,经过十几年舶发展已日 趋完善,特别是PCR技术的介入使整个操作过程变得 简单和实用.早在6O年代Edstrom印已介绍一系列显 徽镱下的操作技术],为现在的显徽镱下超微量的生化 反应奠定了技术基础.1981年欧洲分子生物学 (EMBL)Eds’~rom领导的小组切取了果蝇的x染色体 的第3区段,并成功地进行了克隆脚}1985年,Fisher 等运用显徽切割方法对小鼠X染色俸的近侧区进行了 克隆】}1986年,Bate等傲了人类第2号染色体短臂的 显徽切割和克隆”];1987年,Kaiser.等用显擞切割的方 法对人类第7号染色体长臂的末端区域进行了研究], 从此显傲切割及徽克隆技术迅速地发展起来. 显徽切割技术最初运用于人类染色体时切割的效 率很低,主要原因有二t其一是早期切鲁j的染色体标本 未经显带,而为了便于识别所切割的染色体,必须首先 建立人一鼠杂种纲咆株系}二是当时显般切割下来的 DNA片段通过徽克隆进行扩增,其克隆和扩增所需要 的埽(始拷贝较多,为了满足原始拷贝数的数目,只有增 加切謇j染色俸片段的数量. 1989年Lodecke等首先采用GTG显带染色体标 本进行显徽切割,并将聚合酶链式反应(PCR)技术引 入显擞克隆领峨【”,从而使该技术取得了突破性进展. 但Ltidecke等系运用质粒提供引物接合位点.由于质 粒的分子量高选Zkb以上,而一个质粒仅能提供两个 牯性末端,因此所切割的染色体DNA与质粒连接的有 效性受到了限制.为了提高染色体DNA与霞粒连接的 效率,Lildecke等不得不尽可能多地切割染色体片段和 尽可能地减少连接反应的体积. 我室邓汉湘等采用人工合成的寡棱苷酸引物连接 &辫3 体进行体外酶促扩增及基因克隆,从而使上述问嚣获 得解决,并且连接反应的特异性更高,更有散,整体曼 徽切割,PCR和徽克隆的过程变得简单,快速而高 教?. 本文就我室所建立的人类染色俸曼徽切割,PCR 和徽克隆技术及其应用作一详细介绍. 1人类染色体墨徽切翻,PCR跫徽克艟技来【’ 1.1染色休标本的.I竹 1.1.1显氍切蝴染色休标本的.I鼻取EB病毒转化 淋巴样细胞株悬液用啊臃嘧啶同步,经秋水仙素处理 和甲醇冰醋酸固_定后髑片,用囊蛋白酶溶液按常规 GTG显带. 1.1.2染色休原怔杂交标本的.I叠常规外周血淋 巴细胞用胸臁嘧啶同步,经Brdu和秋水仙素处理后收 获滴片. 1.2染色休显擞切割,PCR及探针池的.I鲁用 DNA合成仪合成10个棱苷酸的连接体与24个桉昔酸 的引物,其序列为t5’cGcGAATTCTGGc1?T3’ GCGAcATG3’引物3’G1lGTTACcTAG5’连接 悼,将连接体与引物以1:1的比倒混合,在饲置显擞 镜下切取30条中期染色体或染色体片段,遥一转移至 油室内,加入蛋白酵K消化后用苯酚和氯仿抽提,然后 加入Sau3A1消化,消化后加入T.DNA连接酶进行连 接反应,完成连接反应后加入Taq聚合酵,引物,dNTP 等进行初级和次级PCR反应,用biotin一16-dUTP标记 次级PCR产物制备探针池. 1.3染色休特异性或染色体区蒂特异性培函 1.3.1探针的竞争性杂交处理取200/~1标记的PCR 产物,加入3O倍超声粉碎的人类基因组DNA,在37”C ““..收稿作者蔫嘉杰<器嚣吩i墨克星薏金庄三器耋蔷;晶’索然科学垒 ll6胡南医科大学.1998,23(2) 啦浴预杂变20mln,然后与变性后的染色体玻片标本作 原位杂交. 13.2染色休免疫荧光原位杂交在杂交用染色体 玻片上加变性液,在70C变性5min,立即投人预冷的 7O,0O,1000A的酒精中,取出后气干待杂变.取经 竞争性杂变处理的探针漓于经变性处理的染色体玻片 标本上,盖上蜡膜,置湿皿中37?条件下杂交16h,然后 在洗脱灌中进行漂洗. 1.33杂吏信号检测洗脱后的玻片用AvidinFITC (fluoresceinlsolhio—eyanate)进性免疫荧光反应,漂洗后 用碘化丙啶(PI)染色,盖上盖玻R及嫩克隆技术自建立来 已被广泛地运用于人类遗传学研究的各十领域(附 图).随着该技术的进一步完善,必将对其它生命科学 研究产生深远的影响. 2.1人类染色体区带专特?l生eDNA文库的构建随 着研究的进展,人类基因组计划已进入对基困达序 列研究的瓤阶段,即通过对eDNA的顺序分析和定位 研究,掏建一个人类基因组的表达图谱或外显子图谱. eDNA代表基因的编码顺序,由于目前从eDNA文库 中获得的eDNA片段平均只有lkb左右,难于FISH方 法进行准确定位,故迄今已测序的564,143个eDNA 中只有一小部分完成了染色体定位.村用人类染色体 显檄切割,PCR及微克隆技术构建人类染色体300, 590条带阶段的染色体各区带的专特性探针池,然后用 这种染色体探针池筛选eDNA文库,可望在较短时间 内完成人类染色体各主要区带专特性eDNA文库的掏 建.随着人类染色体定位标记的增多,只要有了某一疾 病典塑的家系,研究者在很短时间内即可把该病的致 病基因定位于某号染色体的某一区带.因此,掏建人类 染色体区带专特性eDNA文库可成为获得其致病基因 的捷径. 我室利用人类染色体显教切割,PCR及微克隆技 术构建了5q13和zq33区带专特性探针池,并筛选丁人 类brainstem和bnfrontalcortexcDNA文库.5q13 区带获得了2十eDNA克隆,2q33区带获得了11个 eDNA克隆,经FISH定位发理有4个eDNA克隆分别 来自2q33和5q13,用2q33区带探针池筛到的一个cD— NA克隆中还包含丁一个双桉苷酸多态重复,连锁分析 显示该克隆与原来定位于D2S7Z/D2S116的ALS2位 置紧密连镇0】. 2.2人类染色体区蒂专特性pUC19文库的构建人 类基因组计划从开始实施至觋今已过去6年余.该计 划的完成,将从DNA分子内破译人类全部遗传信息, 阐明人类1O万个基固在染色体上的捧确,DNA分子组 成,功能和作用方式及在健康和痰病方面所起的作用. 要完成分布在人类24种染色体上所包含的3×10.个 棱苷酸的捧刊胰序分析,首先必须获得大量的遗传标 记,然后I暂建每一条染色体的大尺度物理图谱.1983年 至1986年,美国的两个实验室(NationalLaborator[es atLivemoreandLosAlamos)受能源部的资助,用浇式 细胞分类器和分子生物学技术建立了人类24种染色 体特异性的基因文库.这些文库对分离各号染色体的 专特性遗传标记起了一定的作用.但由于流式分类器 分离不同号染色体的主要指标是染色体的长度,在同 一 组染色体之问,不同号染色体之问长度极为相近,机 器无法辨认,致使长度相近的不同号染色体的污染率 高达10,50. 利用人类染色体显傲切割,FCR技术I暂建人类染 色体3OO,550条带阶段各区带的专特性探针池,然后 把PCR产物克隆到pUCI9载体中,即可在较短时间内 构建完成人类染色悼各区带的专特性pUCI9文库.该 方法不但成为遗传学工作者获得染色体区带定位标记 的快速而有效的途径,而且也为遗传学定位克隆致病 基因打下基础. 目前,我室和用该技术已构建了28个人类染色体 区带特异性的oUCI9文库,并且对人类染色体8q24.1 带pUCI9文库中进行丁进一步的分柝,共获得329个 重组克隆.对其中53个克隆进行分析,发现有36个为 单拷贝序列这些单拷贝片段长度升于105~960hp之 间,平均350bp.本文作者还对31个单拷贝DNA片段 进行DNA顺序分柝,经查基因文库blasta未见同潦序 列为证实所得的单拷贝DNA片段确实来自所切割 区域,笔者还利用两个单拷贝DNA片段分别筛选了人 类基因组DNA文库然后用获得的基因组DNA进行 FISH定位,发现它们确实来自于人类染色体8q24.1 这些单拷贝序列可作为构建人类8号染色体STS图谱 及大片物理图谱非常有用的遗传标记…】. 2.8人类染色悻区带特异性多盎标记的争离遗传 人类染色体显擞切割,PCR,擞克隆技术及其应用夏家辉.等l17 病致病基因的克隆是人类基因组项目的接心:运 用多态标记,通过连锁分析,将某一遗传病的致病基因 定位于染色体的某一限定区域,是克隆该基因的第一 步.微小卫星DNA是近年来迅速发展起来的一种新的 DNA标记系统.是一类简单的短序列核苷酸串联重 复,其中以职接苷酸重复最常见.即(CA)n和(GT)n(n 约为10,60),平均约40kb有一个[1”1989年用 PCR方法证实其有丰富的多态性.由于其多态信息 量(Pie)高.分析操作方法简单,现已广泛应用于遗传 病的连锁分析和物理图谱的绘制.迄1996年3月典有 5,026个(CA)n片段被分离出来{相邻的两个(CA)n 之间,近的已相距不到lcm,世远的仍相距20cm以上. 人类基因组DNA全长约3×10.bp,按染色体1.000条 带阶段计算平均每条带长3cm.利用人类染色体显微切 割,PCR和微克隆技术获得某一条特异性的染色体区 带,然后再在其中筛选含(CA)n的多态标记,这样即可 获得大量的区带特异性(CA)n,从而可用来填补目前染 色体上的(CA)n空白区.绘制一张高分辨辜的遗传连 镄图谱. 基于上述思想,笔者利用人类染色体显微切割, PCR技术获得人类染色体8q24.1带特异性探针池,并 柯建丁8q24.1pUC19文库.经用(CA).寡接苷酸片段 怍探针筛选此文库,共获48十阳性克隆.在已测序的 12个克隆中,发现一个具有11个等位片段的,世界上 未曾报道的8q24.1带特异性微小卫星DNA,运用该多 态标记对我们所收集的遗传性多发性外生性骨疣病家 系进行连锁分析(该病的一部分致病基因已被定位于 8q24.1),致病基因位于8号染色体的家系均与该标记 连镄]. 2.4染色体异常缔夸症的研究标记染色体在新生 儿中约006,0.12,在胎儿出生前的研究中占 0.07,0.15[1”],用细胞遗传学技术难以确诊其 米源.在群体细胞遗传学调查中发现,有的小的额外染 色体能代代相传,并不表现出任何临床症状;而另一些 小的额外染色阵刚导致患者死亡或严重的临除证实细胞遗传学的检查结果之外,还 对一些在细咆遗传学水平上难以确认或不能确认的染 色体异常进行了鉴定.?用显微切割,PCR技术构建的 11号染色体专特性探针池对核型为46,xx,t(11;22) (q23.3;ql1.2)肯定携带者作了绘画,结果完全与用高 分辨染色体技术检查的结果一致,而该洼较细胞遗传 学的橙查更简捷,直观和可靠.?用显微切割,PCR 技术掏建的7号染色体专特性探针池对一例一条21号 染色体长臂末端多一条深带的患者及其母亲作了染色 悼绘画.结果显示母亲的1条7号染色体长臂末端具有 辉煌的荧光信号,从而在分子水平上证实了细胞遗传 学的分析结果,显示了染色体探针池在鉴定异常染色 体来源上的直观性和准确性”.@用显微切割,PCR技 术均建的人类染色体7号和8号专特性探针池对一例 罕见的复杂易位携带者进行了绘画,细胞遗传学检查 初步诊断该携带者的棱型可能为:6.XY,一7,一8,一g.+ der(7)t(7;9)(q2200,p24),+der(8)invins(8;7) (q2100;q31;2q2200),+der(9;7)(p24;q31.2)ishder (7)f(7;9)(wcp7+),der(8)invins(8~7)(wept+,wcp8 +)tder(9)t(9;7)(w?+)】.?用显微切割,PCR构 建的2,7,2l,x和3p26~qter染色体特异性和染色体 区带特异性探针池对一例具有7号染色体异常的智力 低下患者进行丁绘画.细咆遗传学检查患者长臂末端 多一条深带,为7q+标记染色体,而患者父母棱蛩均正 常,故不能确定患者的7q+标记染色体附加片段的来 源.染色体绘画结果证明患者标记染色体的附加片段 来自3号染色体长臂末端. 2.5基因定怔和基因克隆由于DNA组技术在人 类遗传学研究中的应用.已克隆到大量?圯名DNA片 段.特别是近两三年来cDNA的序列分析进展很快,每 天都可测定成百上干的EST序列,是基因组数据库中 增长的最快的序列.这些DNA片段的获得大大促进了 人类遗传图谱和物理图谱的制作及遗传病致病基因的 克隆.由于筛选出来的E1s(Sequencetaggedsites)和 EST数量很多.人们习睫+29(2) 片段的序列引钧+然后在用曼散切割方法得到的 探针池中进行扩增.即可快速地对无名DNA片段进行 定位. 我室邓援湘等利用同源顺序筛选法获得了一十与 位于8号染色体上的遗传性多发性外生性骨疣基因 (EXTI)有59同蔼的eDNA片段,通过用显微切割, PCR技术获得的11号染色体和IIPII区带特异性探 针池进行定位,特此片段定位于人类染色体llPll区 带,并于1996年8月克隆了该病位于11号染色体上的 致病基因+即EXT2基因?. 3小结 作者运用人类染色体显微切割,PCR和散克隆技 术已在分子遗传学的许多领域,成功地掏建了24种人 类染色体特异性探针池和47种人类染色体区带特异 性探针池.并成功地将这些探针池用于染色体异常综 合症的研究,染色体特定区域DNA文库的掏建,染色 体区带特异性DNA标记的分离,标记染色体的起源, 人类遗传病的致病基因克隆等方面的研究工作.该项 技术目前还在不断完善和发展+倒如出现了借助激光 束对染色体进行显微切割等.随着该项技术的不断发 展,可望其作用变得越来越重要,而且该法与染色体步 移方法相结合,将撅大地促进人类基因组计划的进展, 并对其它生命科学领域产生谭远的影响. 删整条染色棚条染色体的某一带 检测染色不明原阁l1月原嘲染标记染色环境 体亚带到智力低下的习惯性也染色体进致突 胍精嘲水人群的嫡流产,死体伴起化遗机理 之问的田学研究产的稍当!{源的传学的研 徽小突变学研究构研究研究究 } 究 用单拷贝DNA为人类基因 片段结台它组序列分析 技术缔选与某挺标记 一 疾病相关的 肯诊断价值的 探针进_f6克隆 ~hui?RuanQi~guo,HeXiaoXuan-.SE4? ingfor4?igk?copyDNA~lmemafrccnhumanchromo- lorfie8q24.1.ChinMedJ.1994-107(4)l257 11RuanQinggu~,DengHanxhng,PanQian.at..Map- ping0fhumanchromosome8q24.1single-copyI~obesby fJuo_hescenceinsituhybridization~PosatelliteafrccaHumanChromosome 8q24.1ActsGeneSic?,1997.24(1):1 l6SechsEs,VanHemelJO,DenHollanderJC.. Markerehromo~omesinaser~esof10000prenataldiag? no,isCytogenetioandfollow-upstudies.PrenatDhgn- 1987,7.81 17BlennowE.TelenlusH.hrs$o~.Co捌罕见的复杂墨位基书者 的橐色体培西研究.遗传,1996.23I{):255 21搏倥江,夏索掉,龙意高-等.一倒智力低下患者7q+标 记染色体的来探鉴定.实髓生构,1996.29(2).l5l 船AdamsMD-蹦IcyJM,G,~:ayneJD..Compleme~- taryDNA.equenc【ng{expze~sedsequencetagsandhu. I’t~tD.genomepro~cx.Natu~-1991,252t1651 23DengHanxiang,FanChaohong+XiaJiahui+d.Moist. cloning0fBcandidategene{orhereditarymt~01eex- ostoaestypeI.ProginNatsci,1996,6(6):692