毛冬青对小鼠逆转录病毒感染模型脾大症治疗机制的研究

毛冬青对小鼠逆转录病毒感染模型脾大症治疗机制的研究 毛冬青对小鼠逆转录病毒感染模型脾大症 治疗机制的研究 实验研|究 毛冬青对小鼠逆转录病毒感染模型 脾大症治疗机制的研究 冯鹰符林春肖凤仪 (井冈山学院,江西吉安343000) 提要目的:建立小鼠FLV(friendleukemiavims)感染模型,以抗逆转录病毒药物齐多夫定 (AZT)作为对照药.初步探讨中药毛冬青对该模型脾大症的治疗作用及其机制.方法:将小鼠随机分 为正常对照组,毛冬青高剂量组,毛冬青中剂量组,毛冬青低剂量组,齐多夫定(AzT)组和模型对照 组,每组10只,除正常对照组外均腹腔注射0.4mlx10FLV病毒原液攻毒,攻毒当日开始灌胃口服给 药.实验小鼠于第21d时摘眼球取血处死,计算其脾指数,检测其血清CD4T,CD8T,IL一1,IL_2,IL一6, INF一及病毒滴度.结果:毛冬青高剂量组小鼠脾重量,脾指数以及IL一1,IL一6均显着低于模型对照 组,CD4T,CD4.r/CD8T以及血清细胞因子IL一2,INF一均显着高于模型对照组.毛冬青高剂量组小鼠 与模型对照组相比其血清病毒载量亦显着降低结论:毛冬青具有治疗FLV所致小鼠脾大症的作用, 其机制可能在于其具有一定的抗逆转录病毒及调节机体免疫状态的作用 关键词毛冬青逆转录病毒感染脾大症脾指数细胞免疫病毒滴度Balb/C小鼠 中图分类号R282,710,5文献标识码A文章编号1672—397X(2007)11-0085—02 毛冬青为冬青科植物毛冬青 //expubescemHook.etArm的干燥根.具 有活血通脉,消肿止痛,清热解毒的功 效,在临床上广泛应用于冠心病,心绞 痛,血栓闭塞性脉管炎及中心视网膜炎, 喉头水肿,扁桃体炎,痢疾的治疗,外用 可用于治疗烧,烫伤Il_.化学成分的研究 结果明,毛冬青中主要含有:黄酮类成 分,三萜类成分等【".现代医学研究表明. 毛冬青注射液可以有效治疗小儿由EB 病毒引起的传染性单核细胞增多症,合 胞病毒感染等多种病毒性感染I2-31为更 进一步研究毛冬青抗病毒的作用及其机 制.本实验采用FLV感染的Balh/C小鼠 模型,从脾指数,病毒滴度及CD4T, CD4T/CD8T和血清细胞因子等方面研 究其可能的抗逆转录病毒机制 1实验 1.1实验动物Balb/C小鼠.全雌.14~ 16g,60只,购自广东省医学实验动物中心. 1.2病毒FriendMurineLeukemia Virus(F—Mulv)购自ATCC(American .rvpeCultureCenter),经广州中医药大 学热带医学研究所病毒室传代后冷冻 于一70?低温冰箱中 1I3药物药物MDQ为毛冬青提取 物.由广州中医药大学热带医学研究所 药学研究室提供阳性对照药物AZT (齐多夫定)由厦门制药厂生产.批号: 0302011. 1,4试剂荧光标记单克隆抗小鼠 CD3T—FITC,CD4T—PE,CD8T—PE—Cy5 抗体.流式细胞检测剂均购自北京晶美 基因谷科技有限公司:小鼠白介素一1, 小鼠白介素一2,小鼠白介素一6,小鼠干 扰素一ELISA试剂盒,购自武汉博士德 生物有限公司:实时荧光定量PCR 试剂购自大连宝生物制品有限公司:实 时荧光定量PCR由广州中医药大 学热带医学病毒室自行设计 1.5仪器流式细胞仪(FACSCalibur 型).为美国BectonDickinson公司产 品;恒温水浴箱,酶标仪. 2实验方法 2.1实验动物造模与分组小鼠适应 性喂养1d后,随机分为正常对照组,模 型对照组,MDQ高剂量组,MDQ中剂量 组,MDQ低剂量组,AZT组,每组10只. 除正常对照组外.其余各组小鼠腹腔注 射0.4mlxl0一IFLV病毒原液攻毒Il_攻毒 当13开始灌胃给药.正常对照组,模型对 照组灌胃生理盐水20mY(kg?d);MDQ 低,中,高剂量组分别给予相当于60kg 体重的成人每日每公斤用药量的5倍 (含生药2.166g/l【g),10倍(含生药4.33g/ kg)和20倍(含生药8.67g/l【g)MDQ生理 盐水混悬液20ml/(kg?d):AZT组按 100mg/l(g体重灌胃AZT20mY(kg?d). 每日定时给药.连续21d.1次,d. 2.2脾指数计算小鼠给药21d后.称 体重并摘眼球取血处死.再以眼科剪沿 腹部正中线剪开腹腔.钝性分离脾脏. 清除脂肪结缔组织.鼠脾称湿重按以 下公式计算脾指数: 艏数=鲁×100% 2.3CD4T,CD3T,CD8T细胞计数及 CD4T/CD8T测定取2.2项下部分鼠 血立即加EDTA抗凝处理取鼠血501.1 加入荧光标记CD3T,CD4T,CD8T单克 隆抗体各2.5LLl,室温避光孵育30min 后加入溶血素.10min后以lmlPBS混 悬.1000g离心5-10min.倾去上清液. 上流式细胞仪检测 2.4细胞因子测定取2.2项下部分 中医药田 鼠血不抗凝,室温静置4h后,400Og离 心取血清约400pJ.按试剂盒说明依法 操作,同时检测IL一1,IL一2,IL一6及 INF一^y四项指标. 3实验结果 3.1各组小鼠治疗后脾指数比较见 表1 3.2各组小鼠治疗后CD4T,CD8T, CD4T/CD8T及病毒滴度比较结果见 表2. 3.3各组小鼠治疗后IL一1,IL一2,IL一6 及INF一^v比较以统计软件SPSS12.0 进行One—awayANOVA检验.结果见 表3. 4讨论 小鼠FLV(friendleukemiavirus)具 有逆转录病毒的基本结构.能在感染小 鼠身上产生免疫系统疾患以及与之相 关的脾大症及红白血病.能够较好的拟 合人体感染逆转录病毒后的病理过程, 表现以及治疗效果相较于人类的发病 过程.小鼠感染FLV后具有发病时间 短,病程短,症状明显等特点,故而是一 种较好的研究逆转录病毒的模型[41 逆转录病毒HIV所导致的AIDS 被称为"世纪绝症".人类既往所有的对 付传染性疾病的经验在其面前失去作 用由于病毒是严格的细胞内寄生生 物.其结构简单.RNA逆转录病毒如人 类HIV进入细胞后.病毒复制的全部过 程依赖于细胞.故而现有的治疗手段往 往在杀灭病毒的同时对宿主产生难以 修复的严重损害粉. FIJV感染易感小鼠后.脾脏的重量 变化是一个主要客观指标.从中可以直 接观察到病毒对机体的损害.CD4T与 CD4rr/CD8T是人体细胞免疫的一个重 要指标.也是逆转录病毒感染后病毒危 害的直观反应.在本实验中,毛冬青可 以减小FLV感染小鼠巨脾的重量,提高 小鼠体重.表现出对FIJV感染后小鼠的 巨脾症具有一定的治疗作用.同时毛冬 青可以升高小鼠CD4T与CD4T/CD8T 值.表现出对小鼠免疫系统具有一定的 保护作用.HIV感染后的发病机制有多 种假设.但目前所公认HIV感染引起的 AIDS是以CD4T细胞显着减少.多克隆 B细胞活化和细胞因子失调等为特征 的机体免疫系统紊乱.细胞因子除直接 调节病毒感染细胞中HIV的表达或潜 伏状态外.在调节免疫应答和维持免疫 平衡方面具有重要的作用.AZT在抗逆 转录病毒感染中的机制是它能直接针 囝!兰星兰中压j}6 表1各组小鼠治疗后脾指数比较() 注:与模型对照组比较,P<O.05,P<O.O1;与AZT组比较,Ap<0.05. 表2各组小鼠CD4T,CD8T,CD4T/CD8T及病毒滴度比较(蜘) 注:与模型对照组比较,P<O.05,P<O.O1;与AZT组比较,Ap<0.05. 表3各组小鼠治疗后IL一1,IL一2,IL一6及INF一^y比较(蜘) 注:与模型对照组比较,P<O.05,P<O.O1;与AZT组比较,AP<0.05,? AP<0.O1. 对病毒的逆转录酶.使得病毒的逆转录 过程终止.从而杀灭病毒 本实验结果显示.MDQ高剂量能够 减少小鼠体内病毒载量.减轻病脾重量 以及升高CD4T,CD4T/CD8T比值,与模 型对照组比较具有显着性差异(P<0.O1) 另外.MDQ高剂量组具有升高被感染小 鼠血清IL一2和INF一^y值的作用,与模 型对照组比较差异显着(P<O.O1):能降 低被感染小鼠血清中IL一1,IL一6值,与 模型对照组比较亦有显着差异(P<O.05. P<O.O1). 从实验结果来看.毛冬青对机体 的保护作用机理与AZT不同毛冬青 直接降病毒载量的作用明显较AZT为 弱(P<O.05).但它表现出较强的调节免 疫功能作用,如升高IL一2,INF-,Y,降低 II,1,IL一6的含量等.目前已知.IL一2具 有促体内免疫细胞生成的作用.INF_一y 则能提高机体的抗病毒免疫.IL一1与 IL一6都与机体免疫的过度活化有关.因 此毛冬青对机体的保护作用主要表现在 对宿主机体免疫系统功能的调节以防止 机体过度免疫活化所造成的对机体本身 的伤害 5参考文献 『11李苑新,袁旭江,朱盛山.RP—HPLC法测 定毛冬青缓释片中原儿茶醛的含量.中 药新药与临床药理.2005.16(4):267 [21赵春玲,李蔷华.中医治疗小儿传染性单 核细胞增多症66例疗效观察中药材.2003. 26(6):464 『31赵春玲,李蔷华,朱南方.益气解毒法治 疗小儿合胞病毒肺炎36例分析.中医药 学刊,2003,21(8):1317 『41蒋岩.评价艾滋病治疗药物鼠模型的研 究进展.中国病毒学,1997,12(3):1 [5]冯鹰,符林春,何金洋,等.从HAART的 缺陷看中医药治疗AIDS的前景.中国 艾滋病性病,2005.11(6):477 作者简介:冯鹰(1975一),女,医学 博士.中医临床基础专业.研究方向:中 医药对病毒性疾病的研究 收稿日期:2007—05一l0 编辑:乔婧昊宁