降糖通脉方对葡萄糖、胰岛素和氧化低密度脂蛋白诱导损伤的血管内皮细胞ET-1、NO的影响

降糖通脉方对葡萄糖、胰岛素和氧化低密度脂蛋白诱导损伤的血管内皮细胞ET-1、NO的影响 降糖通脉方对葡萄糖、胰岛素和氧化低密度脂蛋白诱导损伤的血管内皮细胞ET-1、NO 的影响 中国中医药科技2006年9月第13卷第5期sop.2006Vo1.13No.5 降糖通脉方对葡萄糖,胰岛素和氧化低密度脂蛋白 诱导损伤的血管内皮细胞ET一1,NO的影响 邓奕辉李定祥成细华喻嵘梅志刚 (湖南中医学院中医内科实验室?长沙410(if/) 摘要目的:观察降糖通脉方对由葡萄糖,胰岛素和氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的保 护作用及机制.方法:采用葡萄糖,胰岛素和氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐带静脉内皮细胞损伤模型为 受试对象,观察降糖通脉方(JTrMF)对该损伤细胞膜型的保护作用.各实验组细胞分别施加不同处理因素 48小时后,观察各组细胞活性及细胞培养液中一氧化氮(NO),内皮素一1(ET一1)含量的变化.结果:各组 细胞继续培养48小时后,模型组细胞活力较正常组明显下降(P<0.01),NO含量明显下降(P<0.05),ET 一 1含量明显升高(P<0.05),而不同剂量的JTrMF用药后可以显着地改善细胞活力(P<0.05),显着升高 NO含量(P<0.01),抑制ET一1分泌(P<0.05).结论:降糖通脉方具有一定的保护血管内皮细胞的作用, 可能与调节血管舒缩功能有关. 主题词@降糖通脉方/药理学人脐静脉血管内皮细胞/药物作用体外研究 具有滋阴益气,活血化痰作用的降糖通脉方是治疗2型 糖尿病合并脑梗塞的临床有效方剂L1I2J,为了进一步深讨降 糖通脉方的作用机制,本研究采用人脐带静脉血管内皮细胞 株ECV一304为研究对象,以高浓度的葡萄糖,胰岛素及氧化 型低密度脂蛋白配制的混合液对其进行干预,探讨降糖通脉 方对该损伤细胞的保护作用,为降糖通脉方治疗2型糖尿病 合并脑梗塞提供充足的实验依据. 1实验 1.1主要仪器和试剂 超净工作台,细胞培养箱,倒置显微镜,双目生物显微 镜,酶标仪,电子天平,微量移液枪,细胞培养板等,微孔滤 器. DMEM/F12培养基:不含葡萄糖,美国Gibcobrl产品.胎 牛血清:北京鼎国生物技术发展中心产品.胰蛋白酶:美国 Gibcol公司分装,消化活力1:250.二甲基亚砜(DMSO):美国 Sigma公司产品.噻唑盐(MT?):美国Sigma公司产品.葡萄 糖(分析纯):湖南师范大学化学试剂厂.低密度脂蛋白:美 国Sigma公司产品.胰岛素:丹麦诺和诺德公司产品.N0试 剂盒:南京建成生物有限公司产品.ET一1试剂盒:北京华 美生物有限公司产品. 1.2药物 降糖通脉方提取液(JTrMF):熟地,黄芪,枸杞子,山芋 肉,黄连,地龙,丹参,川芎,水蛭,石菖蒲,2副药共268g,均购 自湖南中医学院附属第一医院门诊药房.水煎浓缩至浓度 为每毫升药液含生药1g.对照药:达美康(G//c/az/de,法国施 维雅药厂及天津华滓制药厂合作生产),以DMEM/F12配成 终浓度为33pg/ml的培养液;尼莫地平注射液(德国拜耳公司 生产),以DMEM/F12配成终浓度为2pg/ml的培养液. 1.3受试对象 人脐带静脉内皮细胞株ECV一304,购自中南大学湘雅 医学院细胞中心,复苏后传三至四代,用于正式试验. 2实验方法 2.1剂量选择 正式试验前取生长良好的部分细胞做细胞毒性试验. 结果表明50r,~/~以下剂量细胞活力较5orrrrIl以上浓度 明显增强,而S00mg/~,100mg/m~浓度对细胞有较大毒性,故 以50mg/ml为正式试验高剂量,2Smg/,ra和12.5mrn1分别 为中剂量和低剂量. 2.2细胞分组及处理 选取生长良好的细胞,待细胞生长呈80%融合,根据前 期预试结果及文献参考L3J换用20mmoVLGlu,3omU/LIns和 200mg/LOX—LDL的?昆合DMEM/F12条件液,将此损伤细胞 随机分为5组,每组8孔,于37?,5%c02孵箱中孵育24小 时.相差显微镜观察细胞形态,见细胞已有部分回缩变圆, 分别向各组加入终浓度为50me/ml,2Smg/~,12.5mg/ m】脚,终浓度为含33pg/ml的达美康和2pg/ml的尼莫地 平培养液(阳性药对照组)以及造模混合条件液(模型组),以 及不含混合条件液的空白组,继续于37?,5%c02孵箱中孵 育48小时. 2.3指标检测 采用倒置显微镜观察细胞生长形态状况;MT?法检测细 胞活性;NO含量检测采用硝酸还原酶法;ET一1含量检测采 用放射免疫法.具体操作严格按照试剂盒说明进行. 2.4统计学方法 计量资料以"平均值-4-标准差"(-4-s)表示,数据结果采 用SPSSl1.5统计软件包进行处理.数据方差齐性的采用完 全随机方差分析;数据方差不齐者采用秩和检验. 3结果 3.1各组细胞活力的比较见附表. 3.2各组细胞液中NO和ET一1含量变化的比较见附表. ? 310?中国中医药科技2006年9月第13卷第5期Sep.2006Vo1.13No.5 附表各组内皮细胞活力,细胞液中NO和田一1 含量的比较(;?s) 与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较?P<0.05,??P <0.01;-7阳性药组比较#P<0.05,##P<0.01 4讨论糖尿病并发脑梗塞的病理机制,目前一般认为与 高血糖,脂质代谢异常,血小板功能异常,血管内皮损伤,特 别是与胰岛素抵抗相关的高血糖症,高脂血症以及高胰岛素 血症对内皮细胞的损伤有关.完整的血管内皮细胞具有对 抗血小板黏附和聚集的作用并能抑制血栓形成.高糖血症, 高脂血症,胰岛素抵抗均能损伤血管内皮细胞.体外实验 中,柴伟栋_4J研究发现高浓度的葡萄糖(Z0n~t,40raM)能促进 内皮细胞(Ec)合成cGMP和ET一1,并上调eNOSmRNA水平, 同时高浓度的葡萄糖和胰岛素可诱发胎牛主动脉内皮细胞 发生凋亡,且两者呈正协同作用,说明高浓度的葡萄糖和胰 岛素能促进Ec死亡,损伤血管内皮,血管内皮细胞受损时, 易于发生动脉粥样硬化,进而易于发生脑血栓形成.有研究 证实J,糖尿病并发脑梗塞者脑血管的舒缩功能发生紊乱, 血管内皮细胞分泌的主要血管舒张因子之一为NO,同时El" 一 1是其分泌的主要血管收缩因子,两者之间要保护分泌的 动态平衡.有研究表明E6J,糖尿病并发脑梗塞患者血液Er 一 1水平较单纯脑梗塞者及糖尿病无血管并发症者显着升 高.El"一1合成与释放增多,直接作用于脑局部血管,引起 血管的强烈收缩,导致脑卒中面积的扩大,El"一1还可直接 作用于神经细胞,促进细胞外钙内流,致使神经细胞内钙超 载,损伤神经细胞,糖尿病时,高血糖与高胰岛素血症还直接 影响到N0的合成与灭活_6J,使N0在体内含量减少,导致脑 梗塞时脑部血流量减少,不利于糖尿病合并脑梗塞的预后. 在本研究中,葡萄糖,胰岛素和氧化型低密度脂蛋白可 诱导内皮细胞分泌El"一1增高,同时NO分泌减少,降糖通脉 方可以抑制损伤细胞分泌ET一1,同时促进损伤细胞分泌 NO,使由血管内皮细胞分泌的这对舒缩血管物质趋于平衡, 改善血管内皮细胞的舒缩功能.血管内皮细胞持续较低水 平释放NO,对维持心脑等重要脏器血液灌注具有重要意义, 降糖通脉方可以通过改善血管内皮细胞的舒缩功能而达到 保护血管内皮细胞的作用. 参考文献 1邓奕辉,陈大舜.糖尿病合并缺血性中风基本病机及治法探讨.中 国中医药信息杂志.2002;9(4):49 2邓奕辉,崔连珠,陈大舜,等.降糖通脉方法治疗糖尿病合并脑梗 塞32例临床观察.湖南中医学院,2004;24(5):40 3柴伟栋,陈家伟,沈捷,等.葡萄糖,胰岛素和氧化低密度脂蛋白对 内皮细胞内皮素一1生成及其mRNA水平的影响.中国微循环. 2003;26(4):74 4柴伟栋,陈家伟,等.葡萄糖,胰岛素对血管内皮细胞功能的影响. 中国微循环杂志,2000;23(4):310 5庞素华,黄文龙.糖尿病合并脑梗死血管舒缩反应能力的研究.临 床荟萃,1998;3(17):732 6柴伟栋,陈家伟.糖尿病内皮依赖性舒张减弱及其发生机制.国外 医学?内分泌学分册,1999;19(2):62(收稿:2005—09—27) 针刺,TDP,闪罐治疗特发性面瘫150例 赵嘉勇(北京市顺义区医院?顺义101300) 1一般资料本组150例患者均系门诊患者,其中,男性89例,女性 61例;年龄最小7岁,最大76岁;左侧面瘫84例,右侧面瘫66例,病 程1,15天117例,16,30天23例,31天以上10例. 2治疗方法取穴:阳白透鱼腰,地仓透颊车,四白,太阳,下关,风 池,合谷,太冲.乳突部疼痛加乳突;鼻唇沟平坦加迎香;人中沟平坦 加人中;颌唇沟平坦加承浆.操作:常规消毒,用华佗牌3o号1,1.5 寸毫针针刺患者的患侧,急性期轻度面瘫,宜浅刺,施用补法得气;重 度面瘫宜深刺,施用泻法得气;非急性期面瘫宜直刺,斜刺,透刺,施 用补泻兼施的手法得气,患者得气后采用TDP照射,患者面部及耳后 交替照射,留针30,4o分钟,然后再用闪罐拔至患者面部潮红或自 觉有发热感,10次为1个疗程. 3治疗结果 3.1疗效标准痊愈:症状完全消失,面部表情肌运动恢复正常. 显效:症状基本消失,面部表情肌能够运动,但肌力略差.好转:症状 稍有好转,面部表情肌不能运动,但不笑,不说话看不出来.无效:症 状基本没有变化. 3.2治疗结果痊愈120例(80%),显效19例(12.7%),好转8例 (5.3%),无效3例(2%),总有效率98%. 4体会特发性面瘫系指茎乳突孔内面神经的急性非化脓性炎症. 表现为病侧面肌周围性瘫痪.常只发于面部一侧,以冬季多发,又称 Bell氏面瘫,真正病因未明.祖国医学认为,本病多由于人体气血不 足,脉络空虚,外邪人中经络,或兼挟风痰,上犯头面,导致面部阳明, 少阳经脉痹阻不通,使气血运行失常,筋脉失养,肌肉纵缓不收而发 病.治宜祛风散邪,活血通络,故针刺风池,乳突能调节经气;合谷为 手阳明经合穴,善治头面诸疾;太冲足厥阴经原穴,用泻法治唇角歪 斜最有效,二穴合用有疏通面部经脉,祛风散邪,调和气血的作用;阳 白透鱼腰,地仓透颊车平刺透穴能疏通面部经气,调和气血;四白,太 阳,下关,迎香,人中,承浆可疏通局部经气;闪罐可祛风散邪,改善面 部血液循环,改善神经水肿状态;TDP照射通过电磁波的温热效应. 可直接扩张局部痉挛的血管,疏通经络,增加血液循环,改善局部神 经细胞的营养状况.以上诸法合用,可祛风散邪,疏通面部经气,调 和气血,促进面部血液循环,消除神经水肿及炎症,改善肌肉功能,使 面部功能恢复正常. (修回:2006—06—05)