二烯丙基三硫化物键合硅胶的制备、表征及抗菌作用

二烯丙基三硫化物键合硅胶的制备、征及抗菌作用 二烯丙基三硫化物键合硅胶的制备、表征及 抗菌作用 第24卷第7期 2007年7月 应用化学 CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY V01.24No.7 July2007 二烯丙基三硫化物键合硅胶的制备,表征及抗菌作用 李来生杨汉荣.罗丽萍周礼胜陈雄泉. (南昌大学分析测试中心;生命科学学院南昌330047) 摘要采用固液相表面连续反应法,制备含硫的偶联剂一巯基丙基键合硅胶(MiX5),通过引发剂,使偶联 剂键合硅胶表面的巯基与二烯丙基三硫化物发生巯烯加成反应制备二烯丙基三硫化物键合硅胶(DTS).采 用元素分析,红外光谱,热重分析和质谱分析测试技术进行结构表征,MPS和DTS的键合量分别为1.73和 0.27mmol/g.通过抑菌环试验考察了DTS对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,产气杆菌和变形杆 菌的抑菌活性,抑菌环分别为9.0,8.1,10.1,9.2和8.9mm.实验同时采用搅拌涂布平板法考察了牛肉膏蛋 白胨基中DTS含量对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果的影响.结果表明,DTS对5种细菌均有良好的抑 制活性.消除了蒜素固有的浓烈的大蒜气味,同时保存了二烯丙基三硫化物的抗菌活性.初步探讨了该DTS 的抗菌机理. 关键词二烯丙基三硫化物,制备,表征,抗菌作用大蒜 中图分类号:O621;TQ050.4文献标识码:A文章编号:1000-0518(2007)07-0782-04 大蒜(Alliui'nSativumL)为单子叶植物百合科葱属植物蒜的鳞茎,为香辛热,熟甘温,归人脾,胃,肺 经….大蒜具有抗菌,消炎,杀虫,抗癌,降血压,降血脂,预防动脉粥样硬化,提高机体免疫等功能,是白 色念珠菌,隐球菌等真菌及多种革兰阳性和阴性菌的"天然广谱抗生素"l2].大蒜内含有的二烯丙基 三硫化物称为大蒜新素.是一种广谱抗霉菌,抗细菌的药物l2].将大蒜新素化学键合到大表面甚至纳 米硅胶表面,不但可能消除蒜味,增加抗菌接触面积,减小抗菌剂用量,提高抗菌效力,还可再生使用,由 于载负大蒜新素硅胶为粉状固体可方便地用作药膏药基,对大蒜有效成分的深层次开发利用有应用前 景.本文采用固液相表面连续反应法,首先将偶联剂,巯丙基三甲氧基硅烷以硅氧键合到硅胶表面得 到1,.巯丙基键合硅胶前体(MPS),然后在引发剂的存在下,将偶联剂键合硅胶表面的巯基与二烯丙基 三硫化物发生巯烯加成反应,制备二烯丙基三硫化物键合硅胶(DTS)抗菌材料.用元素分析,红外光 谱,热重分析和质谱分析测试技术对其结构进行了表征.通过抑菌环试验和涂布平板法试验考察了它 的抗菌性能,初步探讨了它的抗菌机理. 1实验部分 1.1仪器和试剂 ElementarvarioEL型元素分析仪(德国);Magna.IR550型红外光谱仪(Nicolet);DT-40 型热分析仪 (Shimadzu);ZQ-4OOO/2695型四极杆LC/MS联用仪(美国Waters公司),配有电喷雾离子(ESI)源和 MassLvnxV4.0工作站;AnkeTGL.16C型离心机(上海安亭科学仪器 厂);LDZX-40BI型立式自动电热压 力蒸气灭菌器(上海精密仪器仪表公司). 无定型硅胶(粒度约100m,比表面积约300m/g,青岛海洋化工厂),,y-巯丙基三甲氧基硅烷 (TM580.I>95%),二烯丙基三硫醚对照品(?98.5%),实验使用二烯丙基三硫化物(自制,纯度为 95%),NaC1和NaOH为分析纯试剂,蒸馏水和生理盐水(自制),牛肉膏(山东梁山科晶生物制品有限公 司),琼脂,蛋白胨(北京恒业中远化工有限公司). 1.2二烯丙基三硫化物键合硅胶的制备 参照文献『5,6]方法制得二烯丙基三硫化物,其色谱峰由对照品溶液确定,纯度由HPLC面积归一 2006-09-05收稿,2006—12436修回 江西省教育厅科技基金资助项目(JJ2006-07,JJ2007—18) 通讯联系人:李来生,男,博士,教授;E-mail:lilaishengcn@163.tom;研究方向:色谱分离材料与生化分析 第7期李来生等:二烯丙基硫化物键合硅胶的制备,表征及抗菌作用783 法确定为95%.二烯丙基三硫化物键合硅胶(DTS)的制备路线见Scheme1.先采用3mol/LHCI对硅 胶进行预处理,静置过夜,用水洗至中性,然后在160oC下烘烤除水活化6h,冷后保存于干燥器中备用. 取10g经活化干燥的硅胶于250mL圆底烧瓶中.加入150mL处理过的无水甲苯,搅拌下加入8mL . 巯丙基三甲氧基硅烷.在N,气保护下.于100,120oC油浴加热回流反应12h,冷却,抽滤,用甲苯作 溶剂索氏抽提12h,再依次用甲苯,丙酮,甲醇和丙酮洗涤,80?下真空干燥5h得偶联剂键合硅胶,即 . 巯丙基键合硅胶(MPS).量取6mL二烯丙基三硫化物于250mL圆底烧瓶中,加入120mL无水甲苯 和0.6mg过氧化二异丙苯(DCP),磁力搅拌下加入6gMPS,在N,气保护下,在100,120oC油浴加热 回流,反应12h,冷却,抽滤,索氏抽提,然后用甲苯,丙酮,甲醇和丙酮洗涤,经真空干燥10h即得DTS 和MPS样品.所制备的DTS样品没有大蒜气味. MPS+CH2一CHCH2SSSCH2CH—CH2 9cH3 SiCH2CH2CH2SHMPS I OCH3 OCH I SiCH,CH,CH,SCH,CH,CH,SSSCH,CH—CH,DTS f OCH3 Scheme1Preparationschemeofdiallyltrisulflde—bondedsilica(DTS) 1.3供试菌种和菌悬液的制备 金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,产气杆菌和变形杆菌菌种均由南昌大学生物系实验室 提供.参照文献[7]方法制备菌悬液,根据实际需要稀释成约1×10.cfu/mL. 1.4抑菌试验 按照文献[8]方法牛肉膏蛋白胨培养基配方(牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaC15.0g, 蒸馏水 1000mL,利用1mol/LNaOH溶液调节pH值为7.4,7.6)和制备步骤,制得牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 和牛肉膏蛋白胨液体培养基.在1.2MPa,121oC下高压蒸汽灭菌20min.将已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼 脂培养基冷却至50?左右,每皿20mL分装到无菌平皿中,水平放置待凝固后,将平板倒置37?恒温 箱中24h后,取出.检查若无菌后,在超净工作台上,用无菌吸管分别吸取0.2mL的金黄色葡萄球菌, 大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,产气杆菌和变形杆菌5种细菌接种于牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上,用无 菌三角涂布棒涂布均匀后,分割成4部分,再用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片(d=5mm)分别浸入生 理盐水中,再在每片滤纸中沾满等量的DTS或MPS样品,按无菌操作将滤纸片贴在相应的区域.将上 述贴好滤纸片的接种平板倒置于37?温室中.培养24h后取出,抑菌圈的大小,初步评价DTS的 抑菌效果. 将5瓶均分装200mL的已灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基冷却至50?左右.再分别将0.04,0.20, 0.60和1.00g已灭菌的DTS,加入其中的4个三角瓶中,搅拌均匀,分装在无菌平皿中,每平皿分装 20mL.水平放置凝固后.将平板倒置放人37?恒温箱中24h,取出.检查无菌后,按同样的方法制得未 加硅胶的牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基,作为阴性空白对照,得到DTS含量为0.00%,0.02%,0.10%, 0.30%和0.50%的牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基.置超净工作台上,用无菌吸管分别吸取0.5mL稀释 1×10倍的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌悬液加入到上述平板中,用无菌三角涂布棒涂布均匀,37? 温室中倒置培养24h后记录菌落数.计算抑菌率. 抑菌率(%)=旦生×?00% 应用化学第24卷 2结果与讨论 2.1结构表征 元素分析结果为MPS:C6.21%,H1.60%,DTS:C8.15%,H1.90%.按碳含量计算MPS中偶联剂 的键合量为1.73mmol/g,DTS中二烯丙基三硫化物的键合量为0.27mmol/g.DTS热重分析结果为 0.32mmol/g,与元素分析结果接近,约为0.30mmol/g, 红外光谱分析显示,位于硅胶表面的硅羟基的3446.5cm伸缩振动强峰减弱,出现1452.2cm CH的面内弯曲振动及1095.5和803.9cm附近si—O及si—c伸缩振动吸收,说明硅羟基参与了含 甲氧基的TM580的偶联反应;2926.1,2969.6C1TI处峰.属于c—H伸缩振动吸收峰和1630.4cm 的C~---C伸缩振动.结果表明,硅胶表面含有机物,显示硅胶表面偶联了二烯丙基三硫化物配体. DTS经HF酸破坏游离出配体偶联剂的 质谱(图1)分析发现,二烯丙基三硫化物配 体与偶联剂硅胶的加成反应,形成直链型 (m/z=315)为主,环状加成(m/z=389)为 辅.热重分析测得DTS固定相质量损失为 17.1%与键合反应增重相符,说明二烯丙基 三硫化物通过偶联剂键合到硅胶上. 2.2DTS的抑菌活性 DTS对2种G菌(金黄色葡萄球菌和 枯草芽孢杆菌)和3种G一菌(大肠杆菌,产 气杆菌和变形杆菌)的抑菌环数据见表1. 按抑菌环直径>7mm为有抑菌活性判 断…,DTS对G和G一菌均有明显的抑菌活性. 图1DTS电喷雾离子化质谱图谱 Fig.1ESImassspectrumofDTS 表1抑菌环试验结果 Table1Resultofantibacterium-circletest Antibacterium—circle/mmAntibacterium—circle/mm BacteriaBacteria DIMPSDIMPS StaphylococcusattFeus9.06.5Aerobacteraerogenes9.27.0 Escherichiacoli8.17.0Proteusvulgaris8.97.0 Bacillussubtilisl0.16.8 2.3涂布平板法考察DTS抗菌活性 将粒度约为100m不同量的DTS均匀混人琼 脂培养基中,接种最佳稀释度(1×10倍)金黄色 葡萄球菌或大肠杆菌菌液后,培养计数菌落数,结果 如图2所示.图中可见,2种菌的菌落数均随DTS的 增加逐渐减少,并且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 强于大肠杆菌. 2.4DTS的抗菌机理探讨 由于二烯丙基三硫化物是通过化学反应键合至 硅胶表面,其活动范围相对有限,因此,它的杀菌机 理应为"接触式杀菌"或者"吸附式杀菌":病原菌首 先被吸附在硅胶表面,这时键合在硅胶表面的二烯 丙基三硫化物透过病原菌的细胞膜进人细胞质中. 将含巯基的酶氧化为双硫键,使细菌的代谢出现紊 图2DTS含量与平板菌落总数的关系 Fig.2Relationshipbetweenthecontent ofDTSandtotalcolonycount 第7期李来生等:二烯丙基三硫化物键合硅胶的制备,表征及抗菌作用785 乱,从而抑制细胞分裂和破坏病原菌的正常新陈代谢,而有效地抑制和杀灭多种病原微生物. 参考文献 1JiangsuNewMedicinalCollege(江苏新医学院).CyclopediaofPharmacy(中药大辞典)[M].Shanghai(上海): ShanghaiScienceandTechnologyPress(上海科学技术出版社),1994,111 2ZHAOJin—Hui(赵锦卉),GENGShu—Qing(耿淑清).HelongfiangMedical(黑龙江医药)[J],2000,13(2):112 3JIYu.Bin(季宇 彬).PharmacologicalActionandApplicationofAnticancerTraditionalChineseMedicine( 抗癌中药药 理与应用)[M].Harbin(哈尔滨):HelongjiangScienceandTechnologyPress(黑龙江科学技术出版社),1999:94 4YuXin.Rui(于新蕊),CONGYue—Zhu(丛月珠).ChineseTraditionalandHerbalDrugs(中草药)[J],1994,25(3): 158 5ZHANGLi—Ping(张立萍).ChineseTraditionalPatentMedicine(中成药)[J],1989,11(5):53 6ZHENGNan—Zhi(郑南芝).JHunanUnivTCM(湖南中医学院)[J],2000,20(4):36 7TechnicalStandardForDisinfection(消毒技术规 范).MinsterofHealthofthePeoplesRepublicofChina(中华人民共 和国卫生部),2002:43 8SHENPing(沈萍),FANXiu—Rong(范秀容),LIGuang—wu(李广武).ExperimentofMicrobiology(微生物学实验) [M],(第3版).Beijing(北京):HigherEducationPress(高等教育出版社),1999:50 9SONGWei.Guo(宋卫国),LIBao—Ju(李宝聚),LIUKai—Qi(刘开启).ActaHorticultureSinica(园艺)[J],2004, 31(2):263 Preparation,CharacterizationandBacteriostasis ofDiallylTrisulfide—bondedSilicaGel LILai—Sheng",YANGHan—Rong",LUOLi.Ping,ZHOULi—Sheng,CHENXiong—Quan. (.TheCenterofAnalysisandTesting;TheCollegeofLifeScience,NanchangUniversity,Nanchang330047) AbstractThesolid— -liquidsurfacereactionmethodwasemployedforthepreparationofdiallyltrisulfide- bondedsilicagel(DTS).The—mercaptopropyl— bondedsilicagel(MPS)wasfirstlyobtainedwithcoupling reagentandsilicage1.Thendiallyltrisulfide— bondedsilicagel(DTS)waspreparedbythemercapto-alkylene additionreactionbetweencouplingreagentsilicagelanddiallyltrisulfideinthepresenceofinitiator.The surfacestructureofDTSwascharacterizedbyelementalanalysis,FT— IR,thermalanalysisandelectrospray massspectrometry.ThebondedamountsofMPSandDTSwere1.73mmol/gand0.27mmol/g,respectively. TheantibacterialpropertyofpreparedmaterialDTSwasinvestigatedviaantibacterium— circle.Theantibacteri— am— circlesofDTStoStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Bacillussubtilis,Aerobacteraerogenesand Proteusvulgariswere9.0mm,8.1mm,10.1mm,9.2mmand8.9mm,respectively.Theinfluenceofthe contentofDTSinbeefextractpeptonemediumontheinhibitioneffecttoStaphylococcusaureusandEscherichia colibymixing— smearingplatecultivatemethodwasalsoinvestigated.TheresultsshowedthatDTSexhibitsa goodinhibitioneffectonthesefivebacteria.Afterchemicallybonding,notonlyeliminationofthestrongodour ofAlliumSativumL,butalsopreservationoftheantibacterialactivitywerefoundonthesurfaceofDTS. Meanwhile,theantibacterialmechanismofDTSwasproposedbasedontheexperimentalres ultanalysis.A mixing— smearingplateculturemethodcanbeprovidedfortheantibacterialtestofthehydrophobicparticle samples. Keywordsdiallyltrisulfide,preparation,characterization,bacteriostasis,AUiumSativumL