兴奋或抑制汗液分泌对小鼠汗腺水通道蛋白5免疫定位的影响

兴奋或抑制汗液分泌对小鼠汗腺水通道蛋白5免疫定位的影响 第卷第期年月中国组织化学与细胞化学杂志腿望奋或抑制汗液分泌对小鼠汗腺水通道蛋白免疫定位的影响马磊何华赵钢段丽曹荣高蓓第四军医大学西京医院神经内科超声诊断科西安超声诊断科第四军医大学神经生物研究所西安摘要目的探讨兴奋或抑制汗液分泌过程中水通道蛋白在汗腺组织的分布及达变化。方法应用硅橡胶印模及免疫荧光技术测定小鼠在毛果芸香碱或阿托品处理后不同时间点的泌汗功能状态及在汗腺组织的分布和表达。结果静息状态下汗腺分泌细胞及导管细胞中的几乎只分布于管腔侧胞膜在毛果芸香碱刺激后小鼠汗液分泌的高峰期、衰退期及刺激后静息期在汗腺组织的亚细胞分布及表达量均未有明显变化阿托品处理后或小鼠汗腺的分泌反应完全被抑制但在汗腺组织的表达分布未受明显影响。结论在光镜水平兴奋或抑制汗液分泌并不改变在活体小鼠汗腺的分布及表达。关键词水通道蛋白汗腺毛果芸香碱阿托品中图分类号文献标识码同唧仉 『 已 已 一 — — 。 收稿日期—修回日期作者简介马磊男年汉族博士主治医师。通讯作者 水通道蛋白是一族广泛存在于原核及真核生物细胞膜上选择性高效转运水分子或小分子甘油的特异性孔道。目前发现哺乳动物共嬖谥炙赖鞍准赐蚍绞莸谄诼砝诘刃朔芑蛞种坪挂悍置诙孕?蠛瓜偎赖鞍酌庖叨ㄎ坏挠跋飒铩,饕植加诜闻荨?悄ど掀は赴约胺置谛韵偬迦缤僖合佟?嵯佟?瓜俚炔溉槎锏暮瓜俳霰泶镎庖谎切汀,胱臃置谛纬傻纳秆固荻惹挂褐械乃肿涌缒ぷ丝赡懿斡肓苏庖还酞猥 ,逋馐笛楸砻魍僖合偌胺闻萆掀は赴械牡ü芟赴械莫锷鲈嗉瞎芟赴械囊约案蜗赴械木稍谏窬葜省?に鼗蚱渌蜃哟碳ず笥上赴诮峁棺霜鳘酹洫楠楠飒妾瞠飒癃昊蜃华鳘酹洫癃霆铼颡妾洫鳘飒颡裰涟ご佣黾影ざ运肿拥耐ㄍ感元猹恪,壳吧形从醒芯棵枋鲂朔芑蛞种坪挂悍置诠讨性诤瓜俚难窍赴植技氨泶锉浠疚挠τ妹庖哂饧肮柘鸾河?,际醵哉庖晃侍饨刑教帧,牧虾头椒ㄊ笛槎锖鸵?锎沓赡晷坌岳ッ餍?笥傻谒木酱笱笛槎镏行奶峁?逯于,茄谧匀还獍祷肪呈椅挛俊姹曜继跫茄锊幌拗剖澄锖鸵,婊肿槊孔橹皇笛榍案骨蛔?湮彀捅韧啄篇皙戟瞠曷樽矶锸笛橹凶们樽芳勇樽碇钡焦嘧?,哉兆楸巢科は伦?涞攘可硌嗡皙飒窈蠊嘧?潭肯慵畲碜楸巢科は伦?涿肯慵瞠皙戟瞠戟飒戟皙浔,中?笳趴凇?返臀灰栽し来篚就僖悍置谝鸬闹舷?直鹪讵皙飒窦蔼牒蟛舛诤棺刺?婕垂嘧?潭ò?衅反碜楦骨蛔?浒?衅藩皙戟瞠戟飒戟皙浞直鹪诩蔼皙飒窈蟛舛诤棺刺?婕垂嘧?潭ā,诤构δ懿舛ㄐ?蠛笾阏坪瓜俚姆置诠δ茏刺晒柘鸾河?,ú舛í猹铩,,只肪澄露取媸褂米?淦鳘皙锍フ胪肺?揽?a name=baidusnap0>印模材料硅胶基质 —并倒置待硅胶完全沉降于底部后排空上部气体。将摹质和滴液态催化剂 滴加于玻璃培养皿混合均匀后用刮铲涂于小鼠后肢足跖皮肤表面。待混合物硬化后用镊子取下印模置于解剖娃微镜透射光下观察计数个足垫区域的汗滴数日并摄影。组织制备及免疫荧光标记各组动物在涂抹硅胶后硅胶硬化迅速以生理盐水快速经左心室灌注冲去血液随后用含多聚甲醛的磷酸盐缓冲液灌流固定。分离后肢足垫组织置于多聚甲醛后固定后取出并置于蔗糖溶液中过夜直至组织沉底。恒温冷箱冰冻切片机冠状位连续切片厚 在含有一的中浸泡充分洗涤。一抗为兔源抗多克隆抗体识别跨膜蛋白胞内区域的羧基端序列。冰冻切片置于由牛血清白蛋白和配制的一抗稀释液中室温孵育—。洗涤后以标记的驴抗兔荧光二抗 室温避光孵育。洗涤后用含甘油的稀释液封片避光保存。阴性对照省略一抗代以等量正常驴血清其他操作及处理与上述步骤相同。荧光显微镜观察并摄影观察者采用盲法在每个样本中随机选取个视野采用 —测量 汗腺组织荧光标记的积分光密度 。值一平均光密度×面积。统计分析采用单因素方差分析 比较各组间活动汗腺数目和荧光染色光密度值的差异如存在显著差异则采用检验进行两组间多重比较。统计分析由统计软件包完成尸即为显著性差异。结果毛果芸香碱对小鼠泌汗功能的影响汗滴分泌至皮肤表面挤压尚未硬化的硅胶材料形成孔洞镜下观察为近似圆形透光点代表了处于活动功能状态的单个汗腺导管开口的位置。戊巴比妥钠麻醉可以抑制小鼠在应激状态下的情绪性发汗因而对照组在注射生理盐水后未出现町以观察的汗液分泌反应图。小鼠在毛果芸香碱刺激后出现稳定的泌汗反应其汗腺分布于足掌及足趾皮肤在足垫图及足趾末端较为集中毛果芸香碱刺激后小鼠足垫仍可见较多的汗滴分泌图后未察到明显的分泌反万方数据中国组织化学与细胞化学杂志第卷应图。小鼠的活动汗腺数目在毛果芸香碱刺激后及士明显高于处于静息状态?的对照组小鼠而毛果芸香碱刺激后小鼠活动汗腺数目与对照无明显差别。毛果芸香碱对小鼠汗腺亚细胞定位的影响以正常血清代替特异性第一抗体的阴性对照未出现阳性产物的染色。对照组小鼠汗腺组织分泌细胞的管腔侧胞膜可观察到较强的免疫荧光标记导管细胞的管腔侧胞膜也可见阳性产物的适度表达汗腺以外皮肤组织的表皮层、真皮层及血管等结构均未见的特异性染色图。毛果芸香碱刺激后各时间点在小鼠汗腺分泌细胞的表达分布与对照组小鼠相同免疫荧光强度也与对照组相似图。毛果芸香碱刺激后各时间点荧光标记值分别为?士及?与对照组静息状态?均无明显差别。以上结果提示兴奋汗液分泌的过程中在小鼠汗腺组织的亚细胞分布及表达量并没有明显变化。阿托品对小鼠泌汗功能及汗腺分泌细胞亚细胞定位的影响以往研究】及本研究的预实验均表明阿托品处理后毛果芸香碱不能引起小鼠汗腺的分泌反应。阿托品处理后及硅橡胶印模显示小鼠无可见的汗液分泌而免疫荧光标记提示荧光值分别为?和?与对照组静息状态?无明显差别。讨论汗液和唾液分泌的起始及终止非常迅速可能参与了这种快速调节过程。毛果芸香碱刺激后基因敲除小鼠的唾液粘稠而高盐分泌量明显减少活动汗腺数目亦显著降低提示是分泌腺体水分子跨膜转运过程的限速蛋白之一。对大鼠唾液腺腺泡细胞的体外实验表明静息状态下位于胞浆内乙酰胆碱处理后转位至细胞顶膜并与脂质卵筏解离后重新分布至胞浆内而毛果芸香碱和西维美林可以较为持久地内引起细胞顶膜的表达上调。促胆碱能药物激活毒覃碱受体后如果唾液腺细胞的不能相应地转位至顶膜则可以引起口干燥症。汗腺的结构、功能及分泌调控机制与唾液腺相似因此汗液分泌过程中也可能存在的细胞内转运活动。然而本研究在活体小鼠发现静息状态下汗腺分泌细胞中的只分布于管腔侧胞膜在胞浆内几乎无表达在毛果芸香碱刺激后小鼠汗液分泌的高峰期、衰退期及刺激后静息期在汗腺组织的亚细胞分布及表达量均未有明显变化同样尽管阿托品可以抑制小鼠汗腺的分泌反应但是并不能影响在汗腺组织的表达分布。以上结果与对活体大鼠腮腺和下颌下腺的研究相一致在兴奋或抑制唾液腺的分泌反应后在电镜和光镜水平均未发现的弧细胞分布受到影响。本研究未能在电镜水平观察汗腺组织是否存在的胞内再分布现象因而研究结论具有一定的局限性。在整体动物水平不能观察到体外实验所 见的激活分泌腺体细胞后在胞内的再分布现象这可能与麻醉药物及组织固定的影响有关。全身或局部麻醉均可抑制小鼠汗腺的基础分泌也可能影响的胞内转运过程。然而避免麻醉药物干扰的活体实验仪发现大鼠腮腺小叶间导管细胞在兴奋唾液分泌后出现胞内的转位现象而腺泡细胞无此表现。导管细胞不具有分泌功能因此导管细胞内的亚细胞再分布可能对唾液分泌无重要的生理意义麻醉药物的影响也并不是体内外研究结果存在差异的主要原因。此外多聚甲醛固定可能会掩蔽结合于胞浆内结构的的某些抗原表簇。水通道蛋白介导的跨膜水分子转运功能主要受以下机制调控改变胞膜上的含量如糖皮质激素和高渗环境可以分别诱导和的表达上调。调节的活性、、、都含有蛋白激酶和蛋白激酶的磷酸化同源序列这些水通道蛋白受磷酸化作用直接调节其活性。亚细胞再分布、、、在某些因子的作用下可在胞内贮存囊泡与质膜之间穿梭进而调节胞膜对水的通透性。本研究提示汗腺组织中的在静息状态或汗液分泌过程中均主要在管腔侧胞膜表达且其表达量无明显变化。因此在汗万方数据第期马磊等兴奋或抑制汗液分泌对小鼠汗腺水通道蛋白免疫定位的影响腺分泌过程中的活性可能受到某种调控从而增加胞膜对水的通透性。综上所述本研究表明兴奋或抑制汗液分泌并不改变在汗腺的亚细胞分布及表达量。但目前尚不能排除在电镜水平或离体培养的汗腺细胞中兴奋或抑制汗液分泌可以引起在胞内转位。参考文献 — 。 —— — 卜 — — — — — — —图版说明图对照组小鼠在背部皮下注射生理盐水后未观察到汗液分泌反应。图对照组小鼠足垫皮肤组织的表达。图显示图中放大部分。汗腺分泌细胞及导管细胞的管腔侧胞膜均可观察到的免疫荧光标记。图毛果芸香碱刺激后小鼠足挚的泌汗状态。图中足垫上大量近似圆形透光点是汗滴渗入印模形成的代表了处于活动功能状态的单个汗腺导管开口的位置。给于毛果芸香碱后小鼠足垫汗腺出现稳定的泌汗反应。图毛果芸香碱刺激后在小鼠汗腺组织的表达分布。图显示图中放大部分。在小鼠汗腺组织的表达分布及免疫荧光强度与对照组相似。图毛果芸香碱刺激后小鼠足垫仍可见较多的汗滴分泌。图毛果芸香碱刺激后在小鼠汗腺组织的表达分布。图显示图中放大部分。在小鼠汗腺组织的表达分布及免疫荧光强度与对照组相似。图毛果芸香碱