小鼠骨髓多染红细胞微核试验[精华]

小鼠骨髓多染红细胞微核试验[精华] 小鼠骨髓多染红细胞微核实验 目的和意义 微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损伤，以确定该受试物有无诱变性。通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞微核测定方法。 原理 正常细胞的有丝分裂的分裂中期，染色体均匀地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成两份，分别向两极移动，并在末期分别形成两个子细胞的核。如果由于某种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断裂，在进入分裂后期时，这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近，当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。 由上可见，微核的出现和染色体畸变有密切相关性，同时微核的观察是在细胞的间期，不必中期相，这比分析染色体畸变要方便一些。进行骨髓细胞微核分析一般观察红细胞，记数嗜多染红细脑中微核出现率。 器材与试剂 1、器材 载玻片、推片、血细胞计数器、滴管、注射器、解剖剪、镊子、止血钳、晾片架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜(或荧光显微镜)。 2、试剂 小牛血清; 甲醇; 吉姆萨储备液:将1g 吉姆萨倒入研钵内，加入少许甘油混合研细，分次倒入剩余的甘油至66ml，转移到烧杯内(或试剂瓶内)。放入55~60?水浴中并不断搅动至2h。取出冷却后加入60ml甲醇，混匀后置室温，2~3周后过滤，保存于棕色瓶内备用(存放时间越长染色效果越好)。 吉姆萨染色液:实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液(pH 6.8)1 : 9混匀。 磷酸盐缓冲液(pH 6.8) 阳性对照物:环磷酰胺。 操作步骤 一、试验动物及处理 1、动物的选择:选用小鼠，每组10只动物，雌雄各半。小鼠体重在18~20g，7~12w。 2、染毒途径:采用腹腔注射给药。 3、剂量选择:环磷酰胺按50mg/kg剂量染毒，同时设立阴性对照(空白对照)。 4、染毒次数和取样时间:采用30h给药法，即两次给药间隔24h，在第二次给药后6h处死动物采集骨髓。 二、骨髓液的制备和涂片 脱颈椎处死小鼠，立即取出胸骨，除去胸骨上的血液和肌肉，横向切断胸骨，暴 露骨髓腔挤出骨髓，小心地涂布于载玻片一端的胎牛血清液滴里，混匀涂片。 三、固定 骨髓涂片于空气中晾干后，放入甲醇中固定15分钟，取出自然晾干。 四、染色 固定晾干的玻片在吉姆萨染色液中染色10,15分钟，然后冲洗掉玻片上的染液，自然晾干。 五、镜检 先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。成熟的红细胞呈桔黄色，而嗜多染红细胞呈灰蓝色。微核大多数呈圆形或椭圆形、单个或多个、边缘光滑整齐，染色与核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 六、结果分析与评价 微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位，每组动物计算微核PCE均值的。正常的PCE/NCE约为1(0.6~1.2)，如比值<0.1，表示PCE形成受到严重抑制，受试化学物的剂量过大，试验结果不可靠。