低葡萄糖连续培养的酿酒酵母过量生产苏氨酸醛缩酶会抑制丙酮酸脱氢

低葡萄糖连续培养的酿酒酵母过量生产苏氨酸醛缩酶会抑制丙酮酸脱氢 低葡萄糖连续培养的酿酒酵母过量生产苏氨酸 醛缩酶会抑制丙酮酸脱氢酶的生物合成作用 —酿酒酵母(S. cerevisiae)丙酮酸脱羧酶缺陷(Pdc)突变体需要少量乙醇或醋酸盐才能维持需氧的、低葡萄糖生长。这种营养需求是由于i脂质和赖氨酸的生物合成需要胞浆乙酰-CoA，ii不能将线粒 — 体基质中的乙酰-CoA转移到细胞质中。为了验证这种假设说并消除PdcS. cerevisiae对C的需求，2—我们尝试采用一种胞浆乙酰-CoA合成的替代途径。将L-肉毒碱加入培养基中并不能恢复Pdc在葡萄糖上的生长，这明酿酒酵母对C的需求不仅仅是因为它不能合成这种化合物。酿酒酵母GLY1 2 基因编码苏氨酸醛缩酶(EC4.1.2.5)，这种酶催化苏氨酸裂解为甘氨酸和乙醛。GLY1基因的过表达 —能使Pdc菌株在碳限制连续培养中以葡萄糖为唯一碳源生长，这表明由苏氨酸醛缩酶产生的乙醛可作为胞浆乙酰-CoA合成的前体。分馏法研究发现了苏氨酸醛缩酶在胞浆中的定位。培养过程中甘氨酸的缺乏表明苏氨酸醛缩酶生产的所有甘氨酸都被同化或异化了。这些实验结果证实了丙酮酸脱 — 羧酶参与了胞浆乙酰-CoA的合成。在分批培养中PdcGLY1基因过表达菌株仍然对葡萄糖敏感。 —就像其他Pdc菌株一样，此菌株在过量葡萄糖分批培养中不能生长，并且将其从葡萄糖限制培养基转移到葡萄糖过量培养基时会分泌出丙酮酸。 丙酮酸脱氢酶(PDC)由PDC1，PDC5和PDC6编码，用于它催化酵母酒精发酵中的第一步且是不可逆的反应，所以它一直被认为是一个严格的异化酶。与这个看法一致的是，在葡萄糖复合培养基分批培养中，酿酒酵母PDC缺失突变体比生长率急剧降低，而葡萄糖代谢野生型酿酒酵母可以很好地发酵[35]。 在低残留葡萄糖浓度的需氧低葡萄糖连续培养中，葡萄糖对呼吸酶的抑制作用降低了[4，37]。在这种培养中比生长速率较低，野生型细胞仅通过呼吸作用来异化葡萄糖[4，37]。尽管如此，在这种条 —件下，酿酒酵母Pdc菌株不能以葡萄糖为唯一碳源生长，但往培养基中加入少量乙醇和醋酸盐后可 —生长[10，12]。酿酒酵母Pdc以恢复其菌株这种对C化合物的需求反映出了PDC在胞浆乙酰-CoA2 的合成中起到非常重要的作用,而脂质和赖氨酸的合成需要胞浆乙酰-CoA[10]。PDC催化将丙氨酸转化为胞浆乙酰-CoA的第一步反应，这步反应中还需要乙醛脱氢酶和乙酰-CoA合成酶[17，31，32]。 —与所设想的这个PDC的生物合成作用相一致的是，实验证实Pdc突变体对C化复合物需求的最小2 值符合胞浆乙酰-CoA的理论需求量[10]。 在一定程度上来说PDC在胞浆乙酰-CoA生物合成中的重要作用是令人惊讶的，因为已经知道有几种 —缺乏PDC的酵母菌在葡萄糖上能迅速生长。例如，Pdc菌株在以葡萄糖为Kluyveromyces lactis唯一碳源时生长迅速[2，14]。此外，缺乏PDC的脂质积累酵母，可利用ATPYarrowia lipolytica柠檬酸裂解酶将乙酰-CoA从线粒体基质运输到细胞质中，在线粒体基质中乙酰-CoA由丙酮酸脱氢酶复合物反应得到[8]。ATP柠檬酸裂解酶并不存在于酿酒酵母中，所以排除了这种酶参与胞浆乙酰-CoA合成过程的可能[33]。 通常认为在包括酿酒酵母的真核细胞中 [19，31]，肉毒碱穿梭载体在乙酰-CoA通过线粒体内膜的转运过程中起到很大的作用。尽管酿酒酵母含有编码肉毒碱转移酶和乙酰-肉毒碱移位酶的遗传信息[1，7，27，36，39]，但近来却发现酿酒酵母并不能合成L-肉毒碱[39]。由于并没有研究表明 —L-肉毒碱是否能够使酿酒酵母Pdc菌株在葡萄糖上生长，所以现在仍然不清楚肉毒碱穿梭载体能否催化乙酰-CoA从线粒体基质的输出。 ——酿酒酵母Pdc菌株对C的需求营养要求并不仅仅具有重要的科学价值，Pdc菌株的酒精发酵作用2 的缺乏可能在生物质定向应用方面很有价值。这种菌株另一个已经被证明了的应用就是采用乳酸脱氢酶将糖分解所得的NADH用于具有商业价值的乳酸的合成[29]。在所有这些应用中，消除对C2化合物的需求将会减轻工艺设计的困难。 本次研究是为了检验PDC对于生长在葡萄糖上的酿酒酵母中胞浆乙酰-CoA的合成是否必不可少，研究肉毒碱穿梭载体在将乙酰-CoA从线粒体基质运出过程中可能起到的作用，并通过代谢消 ——除酿酒酵母Pdc菌株对C的需求。下一步的研究目标是在Pdc菌株中过量表达GLY1基因，这个2 基因编码能够催化苏氨酸降解成甘氨酸和乙醛的苏氨酸醛缩酶[21，25]。 表1 用于本次研究的酿酒酵母菌株 菌株 基因型 CEN.PK182 ..............MATa pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2):: loxP CEN.PK111-61A......MAT-a ura3-52 leu2-112 his3-?1 RWB882....................MATa pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2):: loxP leu2-112 his3-?1 RWB893....................MATapdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP leu2-112 his3::pYX022-Aat 材料与方法 菌株和保藏。本次研究所使用和构建的酿酒酵母菌株(如表1 )是CEN.PK家族的同类成员( 38 ) 。原种培养是在30?的摇瓶中，其中为100毫升含有20g/L葡萄糖的合成培养基 。到达稳定期后加入20 , (V/V)甘油,取2毫升存放在-80?保存。 质粒的构建。 在表达载体YEplac181上将GLY1基因克隆到TPI1启动子之后( 15 ) 。根据酿酒酵母M5(34 )的染色体DNA进行PCR扩增得到GLY1基因，PCR时的寡核苷酸引物为: 5-GGAATTCTAGAATGACTGAGTTCGAATTGCCTCCAAAATATAC-3 5-CCGCTCGAGACATGATGCAACTGGAACGC-3 PCR混合物经琼脂糖凝胶电泳后，目的片段分离，用EcoRI和XhoI酶切。酶切后的片段连接到也用EcoRI和XhoI酶切过的pYX042 - AatII质粒上。pYX042 - AatII质粒来自pYX042 (R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州)，将pYX042用AatII酶切，插入其他4个限制酶的酶切位点: XhoI ，BamHI ， SmaI ，NheI，并破坏了AatII的酶切位点。重组质粒pRWGLY1再用NheI和SacI酶切，将获得的目的片段连入已用XbaI 和SacI酶切过的YEplac181载体，得到重组质粒YEpGLY1 。 菌株构建。 RWB882来自CEN.PK182和CEN.PK111 - 61A的杂交(由P. Ko?tter提供，法兰克福，德国)。由此产生的二倍体孢子于56 ?加热15分钟后，在以0.2 ,醋酸钠作为碳源的YP培养基上培养。再用葡萄糖检验所得菌落。PCR检测不能在葡萄糖上生长的菌落，看其PDC6基因是否被破坏。然后在合成培养基中选择所需的亮氨酸营养缺陷型就是RWB882 。为了消除组氨酸营养缺陷型，先转化pYX022得到RWB882。此菌株转入质粒YEpGLY1和YEplac181 ( 15 )后得到GLY1-过表达菌株RWB893 ( YEpGLY1 )和相应的空载体菌株RWB893 ( YEplac181 )。 聚合酶链式反应。根据，PCR使用Vent DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)。PCR反应进行的情况如下:94 ?变性1分钟，然后65 ?退火1分钟，然后75?延伸3.5分钟，共 30个周期。 培养基。根据Verduyn等人的研究成果，连续培养所用的合成培养基成分为:每公升软化水含5g (NH4) SO, 3g KHPO, 0.5g MgSO.7H2O，0.05ml硅防沫剂，以及微量元素( 41 )。培养基在24244 120 ?高温灭菌20分钟后，加入Verduyn等人所述的过滤除菌的维生素溶液( 41 )。储存培养基 中碳源浓度总是250mM。碳源是葡萄糖(6.75 g/L)和醋酸盐( 0.75g/L)的混合物或单独的葡萄糖(7.5g/L)。110?高温灭菌后葡萄糖单独加入。未预先灭菌的纯醋酸加入到高压蒸汽灭菌的培养基中。分批培养和预培养的合成培养基含有1.5 ,的乙醇作为唯一碳源，其他成分同连续培养基。培养基中还要补充L -肉毒碱，其最终浓度为0.4g/L。 连续培养。需氧连续培养温度为30?，工作体积为1升，在2升发酵罐中进行( Applikon ，斯希丹，荷兰)。通过自动加入2M氢氧化钾将pH值控制在5.0。整个连续培养过程中为保持溶氧浓度高于60 ,的空气饱和度，搅拌速度为800rpm，气流为0.5升每分钟。培养基各成分的加入由蠕动泵控制。电传感器控制工作体积保持不变。至少在5倍体积的变化后培养基应仍处于稳定状态，每个体积变化后培养基的干重，葡萄糖浓度，二氧化碳产率和氧的消耗率变化应小于2 ,。持续振荡过程中的溶氧浓度没有研究。培养物样品和流出物的生物量无显着性差异( 小于1 , )。 葡萄糖脉冲实验。葡萄糖脉冲实验是向稳定状态的葡萄糖有限的连续培养过程中加入葡萄糖。实验开始前蠕动泵关闭。为了实现50mM葡萄糖脉冲，将18毫升的50 ,(wt/vol)葡萄糖溶液通过橡胶隔垫无菌注入。在葡萄糖消耗和随后的代谢物消耗过程中，每隔适当时间测定培养物样品在660 nm的光密度和葡萄糖及上清代谢物的浓度。 培养物干重测定。为了确定生物量干重，将已知体积的培养物(干重0.01-0.03克)用预干燥的已知重量的硝酸纤维素过滤器过滤 。该过滤器用20毫升软化水冲洗并在360W微波炉中干燥20分钟，测量过滤器的重量增加。重复至变化小于1 , 。 代谢产物分析。上清中的醋酸，葡萄糖，甘油和丙酮酸的浓度用高效液相色谱法测定分析，用Bio-Rad的阴离子交换柱HPX-87H于60?C测定。该柱用5mM硫酸洗脱，流速为0.6毫升每分钟。丙酮酸和醋酸用Waters 2487双波长吸光度探测器在214 nm测定。葡萄糖和甘油用Waters 2410折射率探测器测定。葡萄糖的浓度用商业罗氏诊断试剂盒(编号716251)确定 。 气体分析。用Rosemount NGA 2000分析器分析氧气和二氧化碳的浓度前，连续培养的废气经冷却和Permapure干燥机干燥。气体流量用离子科学数字流量计测量。具体氧气消耗量和二氧化碳产量的计算使用van Urk等人的方法( 40 ) 。 酶活性测定。细胞提取物的酶活性的测定准备如前所述( 6 )。亚细胞成分的分离使用Luttik等人的方法。( 23 )。细胞色素C氧化酶(EC1.9.3.1 ;Douma等。[ 5 ])和葡萄糖六磷酸脱氢酶(EC1.1.1.49;Postma等。[ 30 ]) ，作为标记酶用于定位研究，于30 ?用日立model 100-60分光光度计根据先前公布的方法进行测定。用Flikweert等人所述的方法测定PDC( 12 )。检测苏氨酸醛缩酶的混合物为含0.1mM HEPES buffer (pH 7.0)，0.05mM 5-磷酸吡哆醛， 88U/mL乙醇脱氢酶(EC1.1.1.1)和 0.15mM 还原型辅酶I的软化水。加入10 mM 苏氨酸后反应开始。用日立100-60分光光度计测定其在340 nm的吸光度来测定还原型辅酶I的氧化。以牛血清白蛋白作为标准，用Lowry法估计细胞提取物的蛋白浓度( 22 )。 酶 %回收的酶活力 微粒部分 可溶部分 苏氨酸醛缩酶 1 94 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 1 101 细胞色素c氧化酶 98 12 — 表2 从需氧的葡萄糖限制的连续培养中获得的GLY1-过表达Pdc菌株RWB893(YEpGLY1)的组 a织匀浆微粒和可溶部分的苏氨酸醛缩酶和标志酶的回收 a呈现的数据来自一个单独的有代表性的实验。复制实验得到类似的结果。 结果 —L-肉毒碱添加到Pdc酿酒酵母连续培养中。最近表明酿酒酵母不能合成L-肉毒碱(39)。如果 — 肉毒碱营养缺陷型是Pdc酿酒酵母需要C化合物的原因，需氧生长、低葡萄糖的连续培养应该可2—以改为添加L-肉毒碱。为了研究这一可能性，做对照组连续培养，Pdc菌株RWB893(YEplac181)以添加了0.4g/L肉毒碱的葡萄糖和醋酸盐作为碳源。培养基中添加L-肉毒碱和不添加相比，不影响单位体积内菌体的碳产量(14.1g/mol)，也不影响葡萄糖(1.07mmol/g/h)，醋酸盐(0.4mmol/g/h)，O(2.95mmol/g/h)，或CO(3.00mmol/g/h)的流量(表3)。当达到稳定状态后，培养基会被换成22—以葡萄糖为唯一碳源但仍包含L-肉毒碱的培养基。在这个培养基中，Pdc菌株从连续培养中洗脱。 — 显然，添加L-肉毒碱不能援救以葡萄糖为唯一碳源的连续培养中的Pdc酿酒酵母。 — Pdc酿酒酵母中苏氨酸醛缩酶过量生产。除了PDS，酿酒酵母的新陈代谢网至少包含一种可选择的反应能提供细胞溶质的C化合物。苏氨酸醛缩酶(EC 4.2.1.5)，GLY1基因编码的合成氨基2 乙酸的关键酶，催化苏氨酸分解为氨基乙酸和乙醛(21，25)。为研究苏氨酸醛缩酶是否会取代PDC在其生物合成中的角色，我们尝试在pdc1Δpdc5Δpdc6Δ菌株中过表达C化合物C化合物GLY1。 22 为判定引入GLY1的表达菌是否会导致苏氨酸醛缩酶的高活力，酶活力在细胞液中测量。携带 —GLY1表达菌的Pdc菌株的苏氨酸醛缩酶活力是0.75?0.01 U mg/蛋白，然而相应空载体菌株的活力低于最低检出量0.005 U mg/蛋白。 为研究过量生产的Gly1p的亚细胞定位，苏氨酸醛缩酶活力从低葡萄糖的连续培养中获得的细胞匀浆中的可溶部分和微粒部分决定。细胞溶质酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在匀浆中的可溶部分全部回收。线粒体标志酶，细胞色素c氧化酶的活力基本上专门位于特殊部分。过量生产菌株中苏氨酸醛缩酶活力基本上专门发现于细胞匀浆的可溶部分(表2)，说明了Gly1p的细胞溶质定位。 —— GLY1过表达消除Pdc酿酒酵母对C化合物的需求。在低葡萄糖连续培养中，Pdc酿酒酵母2—的生长需要添加少量乙醇或醋酸盐于葡萄糖培养基中(10)。像其它Pdc突变一样，Gly1p-过生产 —Pdc菌株不能生长于添加葡萄糖的分批培养中，即使存在少量乙醇或醋酸盐(数据为给出)也不能生长。因此，为验证Gly1p-过生产菌株和空载体对照菌株生长能力，把以葡萄糖为唯一碳源，以0.10/h稀释率生长的需氧混合培养基换成以葡萄糖为唯一碳源的培养基。 正如所料，两种菌株都能在混合了葡萄糖和醋酸盐的连续培养中生长(表3)。在这种条件下，培养物的关键生理学参数，如单位体积菌体的产量和呼吸商(RQ)，对这两种菌株而言没有明显的不同(表3)。培养基中单位体积生物碳和二氧化碳的完全(,97%)回收有一致性，没有明显的代谢物积聚，如乙醇、醋酸盐或甘油，发现浮在培养物表面。 — 在培养基换成以葡萄糖为唯一碳源后，空载体Pdc对照菌株从连续培养中洗脱(图1)。随着葡萄糖和丙酮酸盐的积聚，单位体积生物浓度成指数下降和0.03/h的低剩余生长率一致。先前证明 — 不同基因的Pdc酿酒酵母以相似的方式从连续培养物中洗脱(12)。显然，对照菌株不能在0.10/h的稀释率下维持无醋酸盐的低葡萄糖生长。 — 同样条件下，苏氨酸醛缩酶-过生产Pdc菌株能够以葡萄糖为唯一碳源生长(表3)，说明苏氨酸醛缩酶能提供细胞足够的合成细胞溶质乙酰-CoA的前体。相似条件下，Gly1p-过生产菌株单位体积内菌体获得的葡萄糖产量(0.47?0.01g/葡萄糖)与从野生型菌株获得的产量(0.48-0.49g/ptt)相近。Gly1p-过生产菌株稳态培养副产品形成可以忽略。这说明苏氨酸醛缩酶额外的氨基乙酸生产既不是低葡萄糖连续培养物的异化作用也不是其同化作用。工程菌也能在0.15/h稀释率低葡萄糖下生长(表3)。然而，当尝试进一步增加稀释率为0.20/h时导致菌体冲失。 — 揭示葡萄糖限制培养变为葡萄糖过度培养副产物的形成。为研究苏氨酸醛缩酶-过表达Pdc菌株对额外葡萄糖的短期应答，对稳态、需氧、低葡萄糖的连续培养给予葡萄糖脉冲。当给予一个50mM 的葡萄糖脉冲后，原养型对照菌株CEN.PK113-7D需要2h来完全消耗添加的葡萄糖。葡萄糖的消耗伴随着50mM乙醇和10mM醋酸盐的生成(图2)。在相同条件下，苏氨酸醛缩酶GLY1-过生产 —Pdc菌株需要4h来完全消耗葡萄糖脉冲。没有乙醇或醋酸盐的生成，但对照于野生型菌株，相似 —于不同基因的Pdc菌株(13)，工程菌生产大量的丙酮酸盐(等于30mM;图2)。 —— 表3.苏氨酸醛缩酶-过生产Pdc酿酒酵母菌株RWB893(YEpGLY1)和空载体对照Pdc菌株RWB893 a (YEplac181)在需氧连续培养中的生理学数据 a平均数和标准误差来自复制实验——包含葡萄糖和醋酸盐的混合物(0.25M培养基碳和10%以碳为主要元素的醋酸盐)或只有葡萄糖(0.25M培养基碳)的合成培养基的独立稳态培养。碳回收的计算基于48%的单位体积内生物碳容量(wt/wt)。GLY1代表RWB893(YEpGLY1)。 图1.葡萄糖、代谢物浓度和pdc1Δpdc5Δpdc6Δ对照菌株RWB893(YEplac181)从生长于包含葡萄糖和醋酸盐的混合物(0.25M培养基碳和10%以碳为主要元素的醋酸盐)的合成培养基变为生长于葡萄糖(0.25M培养基碳)为唯一碳源的合成培养基的需氧连续培养(稀释率=0.10/h)的单位体积生物量。曲线显示了单一有代表性的培养物的冲失侧面图。复制实验得到相同结果。 讨论 Pdc- 基因缺失的酿酒酵母对C2复合物的需求可以用来反映PDC蛋白质在合成胞质乙酰辅酶A时的重要作用.可获取的证据表明酿酒酵母不能进行左旋肉碱的原发性合成。在缺少辅因子的合成媒介生长的过程中，这个结果可能预示了左旋肉碱穿梭过程的产生。穿梭过程是指将线粒体的乙酰辅酶A运出到细胞质中。我们的结果表明pdc缺陷型酿酒酵母对C2复合体的需求不是仅仅由左旋肉碱营养缺陷体造成的。这个不一定能推断出线粒体肉碱在酿酒酵母中的穿梭是单向的，就如之前以pdc缺陷型菌株的表型和这种酵母可以进行左旋肉碱的生物合成的猜想为依据被提出的情况一样。然而，添加左旋肉碱的影响的缺失可能反映了左旋肉碱被吸收并通过酵母质膜的能力有限，正如最近已在拥有不同遗传背景的酿酒酵母中证明的一样。只要对酿酒酵母对左旋肉碱吸收的生化反应和控制机理以及其新成代谢有了更好的理解，pdc缺陷菌株将会对在线粒体乙酰辅酶A的运输中的左旋肉碱穿梭作用的研究非常有用。 处于低速的适度特定的生长速率，实验观察有高产苏氨酸醛缩酶的pdc缺陷菌株能够以葡萄糖为原料进行生长,葡萄糖作为其单一碳源,这些结果与推断的PDC在胞质乙酰辅酶A的合成中起重要作用是一致的.通过苏氨酸醛缩酶的高产而生成的乙醛的过程伴随着体积克分子浓度相等量的甘氨酸的形成.在葡萄糖的量很有限时,脂质和赖氨酸的生物合成对胞质乙酰辅酶A的最少浓度需求在之前被估计为1.05mmol/g.因此，在苏氨酸醛缩酶催化下,至少会有1.05mmol/g浓度的胞质乙酰辅酶A被生成。复合通路会发生在GLY1被过度表达的Pdc缺失的菌株的甘氨酸的代谢中。除了细胞蛋白的直接吸收(酵母生物量中的甘氨酸含量为0.29mmol/g)，甘氨酸可能被利用于丝氨酸的合成，通过了丝氨酸羟甲基转移酶和甘氨酸分解系统。如果所有丝氨酸以这种方式被合成，一分子丝氨酸将消耗两分子甘氨酸，也就是说额外的0.37mmol/g甘氨酸会被合成到总的生物量。除此之外，额外的甘氨酸可能会通过与甲硫氨酸的生物合成或者单碳化合物的代谢相结合的甘氨酸分解系统而被转化。 Pdc缺陷菌株不能以葡萄糖作为单一碳源生长表明GLY1基因的调节作用和Glylp基因的调节作用与动力学性质。Glylp可以阻止天然GLY1基因达到细胞对胞质乙酰辅酶A的需求。就Glylp基因的调节特性而言,对天然GLY1基因调节可能主要是以它在氮代谢中的作用为基础。至于其动力学性质，苏氨酸醛缩酶在胞内苏氨酸生理浓度为5-10mM时，其对于苏氨酸的低亲和力可能限制了通过酶的苏氨酸的流出。我们不能排除低程度表达的GLY1会促进低程度的后续特定的生长率的可能性，一旦将在恒化器培养的Pdc缺陷的对照菌株转移到含有作为单一碳源的葡萄糖的培养基中就能观察到这样的后续生长。在PDC缺失的真核生物中，关于苏氨酸醛缩酶是否参与了胞内的乙酰辅酶A的生物合成的研究将会非常有趣。 野生型酿酒酵母发酵产生乙醇和醋酸盐是需氧的过程，这被认为是在以生物量和蛋白质量为导向的工业应用中的实质性问题。在有氧的且碳源限制的恒化器培养中，被改造的Pdc缺陷，GLY1过量表达的菌株既可以不进行乙醇的发酵，又有以葡萄糖作为单一碳源生长的能力。然而，作为表达异源蛋白的寄主或者作为生产左旋乳酸的菌株平台，这种菌株的少许生长特征限制了工业的应用。首先，和PDC被减少表达的菌株相似，在葡萄糖限量的恒化器培养中，工程菌相对于野生菌株0.38/h的速率,只表达了被减少为0.20/h的最大特征生长率。第二点，与PDC蛋白活性被减少或缺失的其他酿酒酵母的菌株相似，它在葡萄糖过量的环境中会生产出一定量的丙酮酸。第三，在分批培养中，依赖于葡萄糖的这种菌株的生长将是无法实现的。 图2.需氧、葡萄糖限制的连续培养对50mM葡萄糖脉冲的新陈代谢应答。(A)酿酒酵母CEN.PK —113-7D(原养野生型菌株)。(B)GLY1-过生产Pdc菌株RWB893(YEpGLY1)。曲线说明对每一 菌株的单一有代表性的葡萄糖脉冲实验。独立复制实验本质上得到形同结果。