维生素C的测定

维生素C的测定 一、实验目的与要求 1.掌握荧光法测定食品中维生素C含量的方法。 2.了解分子荧光法的基本原理。 3.了解F96型荧光分光光度计的使用方法。 二、原理 多数分子在常温下处在基态最低振动能级，产生荧光的原因是荧光物质的分子吸收了特征频率的光能后，由基态跃迁至较高能级的第一电子激发态或第二电子激发态，处于激发态的分子，通过无辐射去活，将多余的能量转移给其他分子或激发态分子内振动或转动能级后，回至第一激发态的最低振动能级，然后再以发射辐射的形式去活，跃迁回至基态各振动能级，发射出荧光。荧光是物质吸收光的能量后产生的，因此任何荧光物质都具有两种光谱:激发光谱和发射光谱。 维生素C又称抗坏血酸。抗坏血酸在氧化剂存在下，被氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸与邻苯二胺作用生成荧光化合物，此荧光化合物的激发波长是350nm，荧光波长(即发射波长)为433nm，其荧光强度与抗坏血酸浓度成正比。若样品中含丙酮酸，它也能与邻苯二胺生成一种荧光化合物，干扰样品中抗坏血酸的测定。在样品中加入硼酸后，硼酸与脱氢抗坏血酸形成的螯合物不能与邻苯二胺生成荧光化合物，而硼酸与丙酮酸并不作用，丙酮酸仍可以发生上述反应。因此，在测量时，取相同的样品两份，其中一份样品加入硼酸，测出的荧光强度作为背景的荧光读数。由另一份样品不加硼酸，样品的荧光读数减去背景的荧光读数后，再与抗坏血酸标准样品的荧光读数相比较，即可计算出样品中抗坏血酸的含量。 操作步骤 三、仪器与试剂 1.仪器:组织捣碎机，离心机，荧光分光光度计(F- 2.试剂: ?百里酚蓝指示剂(麝香草酚蓝):称0.1g百里酚蓝，加0.02mol•L-氢氧化钠溶液10.75mL溶解，用水稀释至200mL。变色范围pH1.2(红),2.8(黄); ?乙酸钠溶液:称取500g乙酸钠溶解并稀释至1L; ?硼酸——乙酸钠溶液:称取硼酸9g，加入35mL乙酸钠溶液，用水稀释至1000mL(使用前配制); ?邻苯二胺溶液:称取20mg邻苯二胺盐酸盐溶于100mL水中(使用前配制); ?偏磷酸——冰醋酸溶液:称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水稀释至500mL过滤后，贮存于冰箱中; ?偏磷酸——冰醋酸——硫酸溶液:称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用0.015mol•L-1硫酸稀释至500mL; ?抗坏血酸标准溶液:准确称取0.500g抗坏血酸溶于偏磷酸——冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，此标准溶液浓度为每毫升相当于1mg的抗坏血酸(每周新鲜配制);吸取上述溶液5mL，再用偏磷酸——冰醋酸溶液定容至50mL，此溶液每毫升相当于0.1mg的抗坏血酸标准溶液(每天新鲜配制); ?溴; ?活性碳:取50g活性碳加入250mL10%盐酸，加热至沸，减压过滤，用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液中无铁离子为止，再于110,120?烘干备用。 四、实验步骤 1.仪器操作条件 2.绘制标准曲线: (1)将制备好的50mL标准溶液(含抗坏血酸0.1mg/mL)倒入三角瓶中，再往三角瓶中加入 2,3滴溴(在通风橱内进行)，摇匀变微黄色后，通空气将溴排净，使溶液恢复为无色，若用活性炭为氧化剂，加1,2g活性炭摇匀1分钟，过滤。 (2)取2只50mL容量瓶，各加入刚处理过的溶液1.0mL，其中一只容量瓶中再加入20mL乙酸钠溶液，用水定容至刻度，此液作为标准溶液。另一只容量瓶中加入20mL硼酸——乙酸钠溶液，用水定容至刻度，此液作为标准空白溶液。 (3)取5支带塞的刻度试管，一支试管中加入2.0mL标准空白溶液，另4支试管中各吸、1.0、1.5、2.0mL标准溶液，再分别用蒸馏水定容至3.0mL。 (4)避光反应:在避光的环境中，迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液，加塞，振摇1,2分钟，于暗处放置35分钟。 (5)荧光测定:选择上述最佳的仪器条件，记录标准溶液各浓度的荧光强度和标准空白溶液的荧光强度，标准溶液荧光强度减去标准空白溶液荧光强度计算相对荧光强度。 3.样品测定: (1)样品处理:称取均匀样品10g(视样品中抗坏血酸含量而定，其含量约在1mg左右)，先取少量样品加入1滴百里酚蓝，若显红色(pH=1.2)，即用偏磷酸——冰醋酸溶液定容至100mL，若显黄色(pH=2.8)，即用偏磷酸——冰醋酸——硫酸溶液定容至100mL，定容后过滤备用。 (2)氧化处理:将全部滤液转入三角瓶中加入1,2g活性炭振摇1,2分钟，过滤。或在通风橱中加2,3滴溴，以下操作与绘制标准曲线同。 (3)取2只50mL容量瓶，各加入5.0mL经氧化处理的样液，再向其中一只加入20mL乙酸钠溶液，用水稀释至50mL作为样品溶液;另一只加入20mL硼酸——乙酸钠溶液，用水稀释至刻度，作为样品空白溶液。 (4)取2支带塞的刻度试管，1支试管中加2.0mL样品溶液为样液，另一根试管中加入2.0mL样品空白溶液作为空白，再分别用蒸馏水定容至3.0mL。 (5)避光加邻苯二胺，以下操作与绘制标准曲线(4)、(5)部分同样进行，得出样品的相对荧光强度。 四(数据处理 1.记录数据，制作工作曲线。 2.计算样品中维生素C的含量。 五(注意事项 1.维生素C在强光下不稳定操作应注意避光，溶液酸碱度对实验影响较大应合理控制。 2.在测定前应详细阅读仪器使用说明，测量过程正确操作。 3.样品的荧光强度应在工作曲线内。 六(结果与讨论