运脾温阳方及拆方对正常及脾虚小鼠脾细胞增殖影响

运脾温阳方及拆方对正常及脾虚小鼠脾细胞增殖影响 运脾温阳方及拆方对正常及脾虚小鼠脾细 胞增殖影响 摘 要,目的:观察运脾温阳方及拆方对正常和大黄致脾虚小鼠脾细胞增殖的影响。方法:采用正常和15,大黄水煎液灌胃造成脾虚模型的小鼠,制作脾细胞悬液经培养后,加入ConA或LPS各50μL后,加入运脾温阳方及拆方50μL,培养72h后用MTT检测。结果,运脾温阳方及拆方对正常小鼠和刀豆蛋白诱导脾细胞增殖具有明显的促进作用,对脂多糖诱导的正常小鼠脾细胞增殖未见有明显的促进作用。运脾温阳方及拆方的各剂量组体外对脾虚小鼠、脂多糖和刀豆蛋白诱导的脾细胞增殖都具有明显的促进作用。拆方中各药作用效果均低于全方组。结论,运脾温阳方及拆方具有促进B细胞和T细胞增殖的作用。 , 关键词,运脾温阳方及拆方,大黄,脾虚,脾细胞增殖,ConA,LPS, 中图分类号,R285.5 文献标识码,A文章编号, 1673-7717,2008,11-2397-03 1 ,, Influence of Yunpi Wenyang Prescription and Its Different Groups of Chinese Herbs on, Proliferation of Spleen CeIl of Normal and Splenic Asthenia Mice ,, ZHU Xuan,xuan,1,YU Xiao,wei,2,DING Yang,2,SHAO Nan,qi,2, ,1.JiangSu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu,China;, 2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029,Jiangsu,China,,, Abstract,Objeetive :To observe the effects of Yunpi Wenyang Prescription and its different groups of Chinese herbs OD proliferation of spleen cell of normal and rhubarb caused splenic asthenia mice.Methods,Adopt the normal and the splenic asthenia mouse,the mice models of spleen deficiency were established by lavage with 15, rhubarb decoction,make spleen cell suspension and cultivation,50μL Yunpi Wenyang Prescription and its different groups were added to spleen cell suspension supplemented with 50μL Con A or LPS respectively and 2 detected by MTT method after 72h cultivated.Results, Yunpi Wenyang Prescription and its different groups could promote the proliferation of spleen cell of normal mice caused by ConA significantly,while the improvement caused by LPS were not significant,Yunpi Wenyang Prescription and its different groups could increase significantly the proliferation of spleen cell of splenic asthenia mice caused by ConA and LPS,The effective of difierent groups of Chinese herbs were lower than whole recipe. Conclusion,Yunpi Wenyang Prescription and its different groups of Chinese herbs could promotethe proliferation of the B achroacyte and T achroacyte, , Key words,Yunpi Wenyang Prescription and its different groups of Chinese herbs,splenic asthenia caused by rhubarb,proliferation of spleen cell,ConA,LPS ,, 运脾温阳方是根据江育仁教授“脾健不在补而在运”[1]创 新学术思想的指导下,由苍术、山楂、肉蔻、炮姜等药物组 成,运用现代先进制成的颗粒剂,临床用于治疗小儿迁 延性腹泻。前期研究明运脾温阳方具有增强机体免疫功能 的作用[2]。为进一步探讨其作用机制,笔者采用正常小鼠脾 3 细胞和大黄造成脾虚模型小鼠脾细胞,给予脂多糖和刀豆蛋白刺激,观察运脾温阳方及拆方对正常小鼠脾细胞和脾虚模型小鼠脾细胞的增殖作用,现报道如下。, 1 实验材料, 1.1 实验动物, ICR小鼠,扬州大学提供,合格证号,SCXK2007-0001。, 1.2 药物与试剂, 运脾温阳方均由江苏省中医院中药房提供大黄,江阴天江药业有限公司,批号,0705095,Tris,NOVON公司产品,Lot1583619NH,4Cl,南京化学试剂厂,批号:060409,RPMI Medium1640,GIBCO公司,Cat.No.31800.022,Lot.No.1285082 EXP.7/08,链霉素,大连美罗大药厂,批号,050707,青霉素,山东鲁抗医药股份有限公司,批号,051227,胎牛血清,北京元享圣马研究所,批号,050320,噻唑蓝,MTT,、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)均为美国Sigma公司产品,细胞培养板,丹麦NUNC公司 。, 1.3实验用仪器, CO2培养箱,Heraeus公司,捷达形态学图像系统,SW-CJ-IP净化工作台,苏州安泰空气技术有限公司,酶标仪,瑞士TECAN公司,型号SUNRISE。, 1.4 药物的制备, 4 运脾温阳方及拆方药,煎煮3次,将3次滤得的药液合并离心浓缩成1g/mL,过0.22μm滤膜除菌,4?冰箱存放,备用。, 2 实验方法, 2.1 运脾温阳方及拆方对正常小鼠脾细胞增殖的影响, 2.1.1 脾细胞悬液的制备 随机取正常ICR小鼠4只,体重20,22g,摘眼球放血处死小鼠,75%酒精浸泡消毒3min, 立即在超净工作台上无菌条件下取脾脏, 用PBS液洗涤3次,用组织匀浆器轻轻研磨至脾呈白色絮状,过200目筛网, 用PBS液冲洗过滤脾细胞,收集脾细胞悬液于10mL的无菌离心管中,加2mLTris,NH,4Cl液吹打均匀,静置。2min溶解红细胞后, 1000r/min离心5min,,P,I1640液洗3遍,用,P,I1640培养液调成浓度为6×10,7/mL脾细胞悬液。, 2.1.2 脾细胞的接种与培养 取96孔培养板每孔加50μL浓度为6×10,7/mL脾细胞悬液,ConA(使终浓度为5ug/mL)或LPS(使终浓度为10ug/mL)各50μL,然后加入运脾温阳方、运脾方、温阳方、健脾方各药5个浓度,终浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL,。设加刺激物组和脾细胞组作对照,每个浓度8个复孔。置37?,5%CO,2培养箱中培养72h。, 5 2.1.3 MTT法检测脾细胞增殖 取培养72h的脾细胞,每孔加入20μLMTT,继续孵育4h,3500r/min离心10min,用1mL注射器小心吸弃上清后加入DMSO150μL,在酶标仪上振荡60s,于λ=540nm处测OD值。, 2.2 运脾温阳方及其拆方对脾虚小鼠脾细胞增殖的影响, 取ICR小鼠24只,体重20,22g,灌胃15,大黄水煎液0.6mL/只,每天1次,连续12天造成脾虚模型备用。随机取ICR脾虚小鼠4只,摘眼球放血处死小鼠。脾细胞悬液的制备、接种与培养,MTT法检测脾细胞增殖同2.1。 3 结 果, 运脾温阳方及拆方对正常小鼠和脾虚小鼠脾细胞增殖结果见表1,4。 表1结果所示,运脾温阳方及拆方的各剂量组体外对正常小鼠脾细胞增殖具有明显的促进作用,对脂多糖诱导的正常小鼠脾细胞增殖未见有明显的促进作用。 表2结果所示,运脾温阳方及拆方10mg/mL、5mg/mL和2.5mg/mL剂量组体外对正常小鼠脾细胞增殖和刀豆蛋白诱导的脾细胞增殖都具有明显的促进作用。运脾温阳方及拆方1.25mg/mL剂量组对正常小鼠脾细胞增殖具有明显的促进作用。表3结果所示,运脾温阳方及拆方的各剂量组体外 6 对脾虚小鼠脾细胞增殖和脂多糖诱导的脾细胞增殖都具有明显的促进作用。表4结果所示,运脾温阳方及拆方10mg/mL、5mg/mL和2.5mg/mL剂量组体外对脾虚小鼠脾细胞增殖和刀豆蛋白诱导的脾细胞增殖都具有明显的促进作用。拆方中1.25mg/mL剂量组体外对脾虚小鼠脾细胞增殖和刀豆蛋白诱导的脾细胞增殖都具有明显的促进作用。 4 讨 论, 小儿腹泻,infantile diarrhea,是一组由多病原、多因素引起的以大便次数增多和大便性状改变为特点的小儿常见病,其中病程在2周~2个月的为迁延性腹泻,persistent diarrhea,,它是婴幼儿的常见病和死亡原因,尤其是迁延性腹泻可导致营养不良、佝偻病的发生,对小儿的危害很大,故而我国卫生部将防治小儿腹泻定为小儿四病防治之一。, 小儿迁延性腹泻的病变机理比较复杂,可分为感染性与非感染性。感染性小儿迁延性腹泻,食物或通过污染的手传播而进入消化道。当机体的防御功能下降、大量的微生物侵袭并产生毒力时可引起腹泻。非感染性小儿迁延性腹泻,主要是由饮食不当引起,以人工喂养的患儿为主。当摄入食物的量、质突然改变超过消化道的承受能力时,食物不能被充分消化吸收而堆积于小肠上部,使局部酸度减低,肠道下部细菌上移和繁殖,造成内源性感染和消化功能紊乱,肠蠕动 7 增加,引起腹泻及水电解质紊乱。, 目前西医治疗迁延性腹泻的主要是积极作好液体疗法、营养治疗法及药物疗法。肠道微生态环境失调是小儿迁延性腹泻主要发病原因,所以在治疗药物的选择中比较一致的认识是慎用抗生素,而采用微生态疗法,以调整和恢复肠道菌群生态平衡,重建肠道天然生物屏障,常用微生态制剂金双歧、丽珠肠乐等,或用肠黏膜保护制剂思密达,以及补充微量元素与维生素等,临床取得了一定的效果。, 郁晓维教授在儿科专家江育仁教授的经验方2号止泻散的基础上,针对小儿迁延性腹泻的拟定,以运脾温阳法为大法,药用苍术、山楂、炮姜、肉豆蔻、茯苓、泽泻补运兼施,补不碍滞,运不伤正。方中苍术辛苦性温,为运脾之要药,又有芳香燥湿之功效。山楂消运兼备,开胃和中,振奋食欲,以治疗其兼证,并助苍术运脾之功。炮姜入脾经,善温脾胃,温中止泻止痛。肉豆蔻既能暖脾行气,又能涩肠止泻,其辛可启动脾阳,醒脾燥湿,使中焦脾土阳气升发,脾气散精。取茯苓、泽泻的利水渗湿之效,又有“利小便即所以实大便”之意。用于小儿迁延性腹泻中的主要证型的治疗,临床初步研究表明在减少患儿大便次数、改善大便性状、增进食欲方面有显著的优越性。运脾温阳法是治疗小儿迁延性腹泻的有效组方。, 前期实验研究证实运脾温阳法具有调节胃肠功能和增强 8 免疫功能的作用。本实验采用正常小鼠和15,大黄水煎液灌胃造成脾虚模型的小鼠,制作脾细胞悬液于96孔培养板培养后,加入ConA或LPS各50μL后,加入运脾温阳全方及拆方,运脾、温阳和健脾方,50μL,培养72h后用MTT检测。结果表明运脾温阳方及拆方对正常小鼠和刀豆蛋白诱导脾细胞增殖具有明显的促进作用,P<0.05,P<0.01,,对脂多糖诱导的正常小鼠脾细胞增殖未见有明显的促进作用。运脾温阳方及拆方的各剂量组对脾虚小鼠、脂多糖诱导和刀豆蛋白诱导脾虚小鼠脾细胞增殖都具有明显的促进作用。说明运脾温阳方及拆方可能是通过增强脾淋巴细胞增殖功能而达到运脾温阳,消积渗湿,改善机体的细胞免疫功能。拆方中各药作用效果均低于全方组,体现了中药复方独特的优越性。, 参考文献 [1] 江育仁.脾健不在补而在运[J].中医杂志,1983(1):6., [2] 张军平,张伯礼,山本清高.中药药物血清的制作方法探讨[J].天津中医药,2004,21(4):274., [3] 孙卫民,王慧琴.细胞因子研究方法学[M].北京,人民卫生出版社,1999,56-59., [4] 朱萱萱,郁晓维,张忠华,等.运脾温阳法治疗小儿迁延性腹泻机理研究――对免疫系统的影响[J].实用中医内科杂志,2006,2,5,,478,479. 9 10