【doc】鸡卵黄特异抗体对人牙菌斑中变形链球菌影响的体内研究

【doc】鸡卵黄特异抗体对人牙菌斑中变形链球菌影响的体内研究 鸡卵黄特异抗体对人牙菌斑中变形链球菌 影响的体内研究 华西口腔医学杂志WCJS2003年8月第21卷第4期?2? 鸡卵黄特异抗体对人牙菌斑中 变形链球菌影响的体内研究 周智周汝俊唐镇胡德渝 【摘要】目的探讨鸡卵黄特异抗体(IgY)对健康人牙菌斑中变形链球菌构成比的影响.方法选择志愿受 试者2,4人,随机分为3组:实验组(9人)使用1.5%IgY;阳性对照组(9人)使用1.7mmol/L洗必太溶液;阴性对照组 (6人)使用PBS缓冲生理盐水,各组均于饭后用药含漱1min,持续3周.分别于用药前,用药中1,2,3周及停药后 1,3,5周记录菌斑指数,并收集光滑面集合菌斑样本在MS及MSB培养基中微需氧环境培养,检测菌斑中口腔链球 菌群及变形链球菌的菌落形成数,各组使用药物前后菌斑中变形链球菌所占比例的变化及变化的延续性.结 果应用IgY后,其菌斑指数无明显改变,但牙菌斑中变形链球菌群在口腔链球菌群中的比例明显降低,并且在较 长时间内(停药后5周)保持菌斑中变形链球菌的低水平.结论IsY处理后牙面菌斑的菌群微生态发生改变,为 进一步研究牙菌斑微生态防治打下基础. 【关键词】鸡卵黄抗体;菌斑;变形链球菌;口腔链球菌群 EffectsofTopicalApplicationofIn蛐uIlo蛐YolkonMutansStreptococciinDentalPb.que ZHOUZhi,ZHOUnuju~,TANGZhen,eta1.(DepartmentofPreventiveDentistry,WestChi naCollegeofStomatotogy,Si— chllzlltVn/,~y,Chengdu610041,Ch/na) 【Abstract】 ObjectiveToevaluatetheinhibitoryeffectsoftopicalapplicationofspecificimmunoglobulinyolkantibodies (IgY)to,,掘 vstreptococcioncompositionofhumandentalplaque.MethodsAtotalof24healthyadultvolunteerswereselect- edandrando~ydistributedintothreeexperimentalgroups.Afterasupragingivalsca1i,thesubjectsweretreatedwithaIlappli- cationofIgYcontainingspray(testgroup,n=9),a0.15%ehlorhexidine(CH)spray(positivecontrolgroup,,l=9)oraplacebo phosphatebufferedsaline(PBS)spraywithoutanyactiveingredients(negativecontrolgroup,rt=6)threetimesdailyforthree weeks.Pooledplaquesamplesfromthesmoothsurfacesofteethwerecollectedformierobiologieanalysisbeforeadministration (baseline,dayO),duringtreatment(days7,14and21)andafterwithdrawaloftheagents(clays28,42and56)andflaqueindex wererecorded.MicrobialcultivationwereperformedbyseriallydilutingthesampleswithPBSsolutionandcultivatingthealiquots onmitissalivariusagar(MS)andMSsupplementedwithbacitraein(MSB)forora/streptococciandmustreptococc/respective- ly.Thenumberofcolony-fomaingunit(CFU)perplatewascountedandthepercentageof,,扎 streptococc/perora/st,c,to,~ indentalplaqueweredetermined.TheeffectofIgYoncolonizationofrrmtansstreptococc/wereal】alyzedbyananalysisofvariance (ANOVA).ResultsTheplaqueindexesremainedunchanged,butmustrc,to~indentalplaquewassuppressedsii- eanflyfollowingashortterm(threeweeks)applicationofIgY,andlowlevelofmustreptococc/persistedforatleast5weeksaf- terwithdrawalofIgY.CondusionTheresultssuggestthattheimmunizationwithspecificimmunoglobulinyolkal1stmn, streptococc/couldbeusefulforlongtermsuppressionof,,缸streptococcicolonizationinhumandentalplaque. 【Keywords】immunoglobulinyolkantibodies(IgY);dentalplaque;m咖s?;ora/streptococc/ 控制牙菌斑和牙菌斑中的致龋菌是预防龋病的 重要环节.研究n卫证实局部使用抗变形链球菌或其 亚单位的鸡卵黄特异性抗体(immunoglobulinyolk, tgY)可以显着降低实验动物菌斑的形成和龋齿发生. 但有关IgY在人口腔中对致龋菌的作用及持续时间 的研究还较少.本研究应用tgY对受试者做被动免 作者单位:610041四川大学华西口腔医院预防科(周智,胡德 渝),江西医学院附属口腔医院口腔内科(周汝俊,唐镇) 疫后,检测受试者牙菌斑中变形链球菌群(mla,o,ns streptococci,简称变链菌)在口腔链球菌群(oralstrepto. cocci)细菌中所占比例的改变,了解IgY对口腔致龋 菌的作用. 1材料和方法 1.1实验材料 1.5%抗变形链球菌鸡卵黄抗体(IgY),喷雾剂型,本课题 组提取配制.醋酸洗必太(ehlorhexidine,CH),浓度为1.7 ? 296?华西口腔医学杂志WC,IS2003年8月第2l卷第4期 mmol/L,喷雾剂型,外观及口感与IgY口含液相一致,自配.磷 酸盐缓冲液生理盐水(PBS)O.O1mol/L,pH为7.0,喷雾剂型, 自配.杆菌肽(Calbiochem.NovabiochemCorporationPotency,美 国).轻唾琼脂培养基(MS培养基)及轻唾一杆菌肽琼脂选择 性培养基(MSB培养基),pH值为7.6,自制b].MCO-1752多功 能三气培养箱(SANYO,日本). 1.2研究对象及分组 选择24名健康志愿者为研究对象.男18人,女6人,年 龄20—23岁.24人随机分为3组:IgY组(实验组)9人,用IgY 口含液;CH组(阳性对照组)9人,用洗必太口含液;PBS组(阴 性对照组)6人,用PBS缓冲液生理盐水.试验采用单盲法, 试验组与对照组所使用的口含液外观,口感均一致. 研究对象纳入要求:身体健康,无系统性疾病;受试前1 月未使用过抗生素,激素,免疫制剂以及含有抗生素的漱口 剂,牙膏等;口腔内无未经治疗的龋齿;口内龋失补牙数小于 4,指数牙无缺失;且口腔内无妨碍口腔卫生的修复体,矫治器 等. 1.3样本收集 1.3.1初次样本(用药前)的收集实验对象全口洁牙,每日 用白玉无氟牙膏刷牙,停止其它口腔卫生2d后,于 15:00—16:0o采集集合菌斑样本.记录6个指数牙(4个第一 恒磨牙,右上颌及左下颌中切牙)的菌斑指数菌斑指数计分 用改良Quigley.Hein菌斑指数计分法;然后以无菌刮匙收集 4个第一恒磨牙颊面及舌面菌斑,立即置入PBS缓冲生理盐 水,送实验室培养. 1.3.2给药及样本收集采集初次样本后,按组给不同的喷 雾剂,每日3次于饭后喷至牙面.上下左右颊舌面各喷3下, 含漱1min.用药后30min内不得进食,饮水和漱口.连续使 用3周后各组同时停药.记录用药1,2,3周时的菌斑指数并 检测菌斑中细菌;停药1,3,5周时继续检测IgY组及cH组; PBS组于停药1周后即停止检测. 1.4细菌接种培养 样本振荡混匀,按10倍稀释法连续稀释到10浓度,取稀 释样本0.1ml接种于MS培养基(做口腔链球菌属细菌培养计 数)及MSB选择性培养基(做变链菌群细菌培养计数);微需 氧(9o%N2,10%co2)37oC,培养48h.计数培养皿中生长的 菌落形成单位数(colonyformingunit,CFU),取均值;计算菌斑 中变链菌群细菌占口腔链球菌群细菌的百分比(变链比),用 变链比来反映菌斑中变链菌的改变. 1.5统计分析 应用SPSS10.0统计软件分析I使用前,中,后菌斑指 数及菌斑中变链比变化差异的总体比较用方差分析,组间两 两比较采用口检验. 2结果 2.13个组的菌斑指数 3个组用药前,中,后的菌斑指数测量值,见表1. 从表1可见,3组间在用药前菌斑指数无明显差异 (P>O.05);用药后,IgY组菌斑指数与PBS组差异无 显着性(P>0.05).但CH组菌斑指数与IgY组及 PBS组均有显着性差异(P<O.05).用药前后自身比 较,IgY组(P>0.05)和PBS组(P>0.05)的菌斑指数 无显着性变化,但CH组在用药前后有显着性差异 (P<0.OO1). 表1实验期间3组受试者的菌斑指数(?) Tab1PlaqueIndexofthethreegroupsoverthestudype? riod(?) 测量时问菌斑指数 组CH组PBS组 用药前 用药l周 用药2周 用药3周 停药l周 停药3周 停药5周 2.2411-t-O.60142.7033-t-O.45552.3333-t-O.3947 2.1289-t-O.42341.7222-t-O.2:52.357l-t-O.28O7 1.981l-t-O.29351.5178-t-O.54352.O567?0.2920 1.8344-t-O.264l1.351l-t-O.30541.8317-t-O.515l 1.8900-t-O.25081.39o0-t-O.47242.O0o0?0.480 1.9822-t-O.21001.4622?0.49l5 2.0l89-t-O.37601.4622-t-O.4462 2.2菌斑细菌的检测 3组实验过程中变链比的变化,见表2,图1.从 表2可见,用药前3组间菌斑中变链比无显着性差异 (P>0.O5).从用药第l周开始,I组变链比下降, 与PBS组相比差异不明显(P>0.O5);用药第2,3周 IgY组和CH组变链比明显下降,与PBS组比较均有 显着性差异(P<0.05),而tgY组与CH组间无显着 性差异(P>0.O5). 停药后,IgY组变链比开始上升.自身比较见 IgY组菌斑中变链比在停药5周后,较基线仍有显着 性差异(P<0.05),说明IgY对变链菌在牙面黏附的 抑制作用显着,并且在停止用药后5周仍能保持此作 用. 表2实验期间3组菌斑中变链比变化(?,%) Tab2Thepercentageofmutansstreptococciperond streptococciindentalptaqueofthethreegroups overthestudyperiod(x?.%) 华西口腔医学杂志WCjS2003年8月第2l卷第4期?297? 2j 20 一 l 一 丑 型. 0 一.一 ' , \' \J..一.. 一 ' ' :— 一 ?' 用前啪药lJ用2川3脚心l脚辱3周翻 时间 图l实验期间3组菌斑中变链比的变化 FiglChangesinthepG~'centageof"ustreptococciperoralstrepto- cocciinplaque' 3讨论 变链菌致龋必须首先黏附于牙面形成牙菌斑这 一 特定的生态环境.研究应用针对变链菌全菌 或亚单位的单克隆或多克隆抗体被动免疫动物和人 均能有效抑制变链菌在牙面上的黏附定植,并能在较 长时间内维持变链菌的低水平J. 本研究未观察到I组菌斑指数有明显下降,只 有CH组菌斑指数下降,这与Hamada等…的结果不 一 致,其原因可能是Hamada实验中使用的是定菌鼠, 菌斑细菌种类单一,而本研究是在正常人口腔环境中 完成.有研究表明菌斑细菌中变链菌只占极少部分, 大约占光滑面细菌总数的2%,7%,甚至少于 1%~7,83.因此笔者认为由于IgY的特异性,它主要作 用于变链菌,而对其它细菌无抑制作用.变形链球菌 的减少不足以改变菌斑细菌的总数,故菌斑指数下降 不明显.至于CH组菌斑指数的下降则与其抑菌谱 广有关. 研究证实...,抗变链菌igY可以抑制变链菌及 结合性葡糖基转移酶合成非水溶性葡聚糖的能力,并 且能有效干扰变链菌对唾液包被的羟基磷灰石的粘 附;对已粘附到羟基磷灰石的变链菌也具有一定的解 脱黏附的作用.这可能是用药期间菌斑中变链比下 降的一个重要原因. Ma等和Loimaranta等研究表明,虽然应用抗 体后细菌的总菌落数没有显着性改变,但变链菌和血 链菌的黏附受到抑制,故其检出水平大幅下降.Ma 等还认为:抗体通过抑制干扰变链菌和血链菌在牙面 的黏附定植而改变了口腔内的生态环境,即不易致龋 的健康菌斑替代了原有的致龋性菌斑.由于微生态 平衡的改变,使得抗体在口腔局部虽是短期应用,但 却可在较长的时间内抑制变链菌在牙面聚集而起到 预防龋齿的作用. 本研究结果显示,使用IgY后受试者口腔中菌斑 指数没有明显下降,但菌斑中变链比却在较长时间内 维持低水平.这说明,IgY处理后牙面菌斑的菌群发 生生态变化,由原来的变链比较高的菌斑转变成低水 平变链比的不易致龋的菌斑.因此认为应用I被 动免疫防龋符合牙菌斑微生态防治的原则. 参考文献 1HamadaS,HorikoshiT,MinamiT,eta1.Passiveinmamization againdentalcariesinratsbyuseofheneggyolkantibodiesspecif- icforcell-associatedghcoeyltmnsfemseofStreptococ~"u.In- feetInmam,1991,59(11),4161-4167 2SmithDJ,KingWF,GediskR.PassivetransferofinmamoglobulinY antibodytoStreptococ~s"uslucanbindingproteinBcallconfer protection8gainstexperimentaldentalcaries,InfectImmun,2001,69 (5):3135.3142 3肖晓蓉主编.口腔微生物学及实用技术.北京:北京医科大 学?中国协和医科大学联合出版社,1992:180-181 4卞金有主编.口腔预防医学.第3版,北京:人民卫生出版社, 2OOO:34 5MaJK.HunjanM,SmithR,et81.Aninvestigationintothemecha- nismofprotectionbylocalpassiveimmunizationwithmonoclonalan- tibodiesagainst&哦?)om"t.InfectImmun,1990,58(10): 3407—3414 6LoinmrantaV,LaineM,SederlingE,et81.Effectsofbovineimmune andnon—immunewheypreparations?thecompositionandpHre— sponseofhumandentalplaque.EurJOralSci,1999,107(4):24 250 7刘天佳主编.口腔疾病的微生物学基础.北京:人民卫生出版 社.1999:17—19 8ThylstrupA,rejerskovO.TextbookofCariolngy.Copenha~n: Munksgardid,1986:64-68 9文冰,周汝俊,杨健,等.抗变形链球菌鸡卵黄抗体对变 形链球菌合成葡聚糖影响的实验研究.上海口腔医学,2OO2, l1(2):141—143 lO周智,赵豫,唐镇,等.抗I,?型变形链球菌鸡卵黄抗 体(IgY)对已粘附变形链球菌的影响研究.中国临床医药研 究杂志,2OOO,31:4901-4902 (2002-0l一24收稿,2003-02—14修回) (本文编辑邓本姿)