养正消积胶囊微生物限度方法学研究.doc

养正消积胶囊微生物限度学研究.doc 养正消积胶囊微生物限度方法学研究 摘要:目的 研究养正消积胶囊微生物限度检查法的准确性和可靠性，并对该品种进行微生物限度检查方法的验证。方法 采用培养基0.5ml稀释法，分别使用5种实验菌株，采用菌液组、供试品对照组、实验组、稀释剂对照组进行3次独立平行试验，分别计算各实验菌每次实验的回收率。结果 各实验菌的回收率均大于>70%.结论 采用培养基0.5ml稀释法进行该药品的微生物限度检查，方法简便可行，重现性好。 关键词:养正消积胶囊;微生物限度;回收率 养正消积胶囊是在中医络病理论指导下研制的一种抗肿瘤的中药复方制剂，由黄芪、女贞子、莪术、人参、灵芝、绞股蓝、土鳖虫、白术、半枝莲、白花蛇舌草、白英、蛇莓、茵陈、徐长卿、鸡内金等组成。据络病理论研究的“三维立体网络系统”空间位置概念和络病的主要病理变化，认为恶性肿瘤的病变部位在于脏腑阴络，脾肾亏虚为其发病之本，热毒滞络、络息成积为其重要病机。治疗以健脾益肾治其本，使脾肾功能旺盛，发挥“养正积自除”之功;辅以化瘀解毒、散结通络之法以治其标，使络通瘀去，热清毒化。然而养正消积胶囊处方中含有的多味中药材含有抑菌成分，可抑制污染微生物生长，这就给药品造成了安全隐患，因此为了更好而有效的保障该药品的质量，我们根据《中国药典》2010年版【1】的要求对养正消积胶囊进行了微生物限度检验方法验证，以期获得更具科学性和准确性的微生物限度检查方法，从而保证检验结果的准确性【2】。 1 仪器与试药 1.1 仪器 生物安全柜:美国Frontline FHC-1200A;生化培养箱;LRH-250F;干热灭菌烘箱:FD204。 1.2 实验菌种 金黄色葡萄球菌【CMCC(B)26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC(B)63501】、大肠埃希菌【CMCC(B)44102】、白色念珠菌【CMCC(F)98001】、黑曲霉【CMCC(F)98003】，来源:中国药品生物制品检定所。 1.3 培养基及稀释剂 营养琼脂培养基 20120702、改良马丁琼脂培养基121018玫瑰红钠琼脂培养基20121209、营养肉汤培养基120610、改良马丁培养基120417，来源:中国药品生物制品检定所。 1.4 样品 养正消积胶囊 石家庄以岭药业股份有限公司提供 批号 120602、120603. 120601、 2 方法与结果 2.1 菌液制备 2.1.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养18,24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养24,28小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50,1OOcfu的菌悬液。 2.1. 2 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5,7天，加入3,5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50,1OOcfu的孢子悬液。 2.1.3 菌液组计数:取1ml上述制备的菌液，加入相应的3块培养基培养，平板计数。 2.2供试品对照组 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100ml，取供试品lOg，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至1OOml，溶解，混匀，作为1:10的供试液。取此液10倍量递增稀释制成1:100，1:1000的供试液。 2.3 方法 2.3.1 预实验取1:10供试液1ml和上述制备好的阳性对照菌液1ml置平皿中，加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混合均匀，放置凝固后，置培养箱中培养。每株试验菌平行制备2个平皿，计数，计算回收率。结果如下: 由以上试验证明本品对金黄色葡萄球菌有一定抑菌性，故采用培养基稀释法进一步对金黄色葡萄球菌进行实验对比。 2.3.1 确认试验 经过多次实验对比得出最佳方法:取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100ml，制成1:10的供试液，静置，取1:10供试液上清液每皿0.5ml，每4个平皿为一组。取上述制备好的阳性对照菌液1ml，分组注入平皿中，倾注琼脂培养基，混匀，凝固后，倒置培养。按平皿法测定其菌数，计算回收率，结果如下: 3 讨论 上述实验明，本品采用常规法对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉均无影响，其实验组回收率均达70%，故霉菌及酵母菌可 采用常规法进行微生物限度检查，但由于本品对金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌性，即采用培养基稀释法(0.5ml/皿)进行方法学验证，经过3次独立平行试验，结果显示回收率均>70%，因此可采用培养基0.5ml稀释法进行养正消积胶囊微生物限度的检测。 参考文献: [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:1部[M].北京:中国医药科技出版社，2010:79,85. [2]肖庆青.《中国药典》微生物限度检查法及其方法学验证[J]. 江西化工，2008，23( 2) : 65, 66. [3]许华玉，杜芸，钱文静，等. 药品微生物限度检查法中细菌和真 1920 菌计数方法的验证实验[J]. 中国中药杂志，2005，30(24):1918 , [4]郑淑艳，王丽环，王彩虹.大败毒微生物检测方法比较[J].临床合理用药杂志，2010，3(4):82,83.