【doc】 吗啡耐受对大鼠脊髓后角星形胶质细胞的影响

【doc】 吗啡耐受对大鼠脊髓后角星形胶质细胞的影响 吗啡耐受对大鼠脊髓后角星形胶质细胞的 影响 中国临床康复暑9茬蒡J2期2005—08—28…版 ChineseJournalofClinicalRehabilitation,August282005Vat9No.32 吗啡耐受对大鼠脊髓后角星形胶质细胞的影响? 简道林,田玉科 135 ? 基础研究? 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室,湖北省武汉 市430030 简道林?,男,l958年生,湖北省宜昌市人,汉族,华中科技大学同济医 学院在读博士,主任医师,主要从事麻醉和疼痛治疗研究. 中图分类号:117454文献标识码:A文章编号:167l5926(2005)32—0135—03 收稿日期:200505—16修回日期:2005—0626(26/X~/YQ) Efiectsofmorphinetoleranceonastrocytesofspinalcord posteriorhorninraIsJianDan—linTianYu—ke.Departmentof Ancsthesiolog).AffiliatcdTImgjith)spital,T…1iMedicalCollege, ttuazhongUf】i,lJrs;【,ofSticm?Pall(ITII?hn,lhlg7.uhall430030.Hu1)ei l】rovinee.China JianDan—Iin?.Studyingfilrlhlltllrat(.(~hicftltlysitJan.1)epartmentof Anesthesiology.Affiliatedl’lltlgjithlstlita1.TIIllgjlMedicalCollege, HuazhllngUniversitvllfScierltPall(1t’el-hnlllllg’,.uhan430030.Hubei }】rovlnee.China Received:20()5一O5—16Accepted:2005一O626 Abstract AIM:Throughtheobservationoftheet”rectsIlllnortlhinetoleranceonthe achebehaviornfratsant1thechangesofexpressinnelltilepositiveproduct offiberacidityproteinofg1ialcel1sonthespinalctlr{lposteriorham.to exploretheeffectsofmorphinetoleranceonastr1)【-destlfspinalcordpos. teriorhorn;nrats. METHoDS:TheexperimentwasdoneintheResearehRoonlofAnesthe. siology,Ton~iHospitalbetweenNovemher2003andSeptember20o4. Buildmode1s:Fhe18SDratswereassignedrandom1vintocontro1group andmorphinetolerancegroupwith9ratsineat’hgr1)up.Thelongitudinal incisinnwascuttlnthel—hackofrats.Catheterizati0nofmicro. polyetylenwasachievedon2enlsubarachnoi(1spaceAtthe4dayof puttingthetube.theratsinthecontro1grnupanllnmrphinetolerance groupweretreatedwith10Fx1salineand10Fxl(20g)morphine throughtubeinjection.onceadayfor5days.Atthe6(1ayafteriniecting themorphine.theratsjnthemorphinetolerancegroupweretreatedwith 10L(5g)morphinebytheintratheealinjectillntoperformmorphine excitationexperiment.(Toobservetheactivatingstatusofastrocyte:Fhe specificsign,glialfibri1iaryacidicproteinstainingofastrocytewasob. servedbytheimmun1)h;stuehemica1method.Meanwhile.theaverageab— sorbancefA1andintegraAwascalculatedtoshowtheexpressiveintensity oftheglialfibri1iarvacidicproteinintheastro(viefthebiggerAvalue showedthattheexpressionnfglia1fibriliarvat,idicproteinwasmore strong).?r(1detecttheresponselatencyofhotinjureddrawingthelegs andsensitivedegreeofnon—iniuredmechanica1irriration:Atthe3dayof puttingtube,theresponselatencyofdrawingthelegsandmechanicalpain thresholdweretester1respectivelyasbasicvalueAtthe6dayofadminis— tration.themechanica1painthresholdwasdetectedbeforemorphineexcita. tiontrial,andtheresponselatencyofdrawingthelegswastestedafterthe morphineexcitationtrial,andthemaxinlunlanalgesiaefficiencywascalcu. 1ated. RESULTS:TotalIv18ratswereinvolvedintheresultanalysis.(1)The changesofthedrawinglegnumberatthe3dayofputtingtubeandbefore excitationtrial:TheIotalpositivenumberoftimesofdrawinglegatthe3 dayofputtingtubeinthetwogroupswasnearlythesame【(O.11?O.33) timesI.Thetntalnumberoftimesofdrawingleghadslightlychangesin thecontrolgroupatthe6daybeforethemorphineexcitationtria1.while thetotalpositivenumberoftimesofdrawingleginthemorphinetolerance groupincreased【(10.66?1.41)times,(P<0.01)J? Themaximumanalgesia efficiencyafterthemorphineexcitation:Itwassignificantlyhigherinthe controlgroupthanthatinthetolerancegroup【(592O?4-(】 O)%,(8.864_:1.42)%, (P<0.01)1.(Therelativearea,oculusdehterantiintegraoculusdehter ofthepositivelyexpressiveproductofglialfibrilia~acidicproteinofglial cellsonspinalcordwerelessinthecontrolgroupthanthatinthemar phinetolerancegroup,respectively【3.417?0.268?6530~0.423<0.01), 0.357土O.024t,s0.520土 O.025(P<0.011.1.689?O.303vs2.3lO?O314 fP<0.011. CoNCLUSIoN:Themorphinetoleranceinspinalcar(Jinducestheache. activatestheastrocvtesinspinaldorsalhorn.Fheastrocytesinthespinal cordmaybeplayanimportantroleintheformationofmorphinetolerance. JianDL,TianYKEffectsofmorphinetoleranceonastrocytesofspinalcord posteriorhorninratsZhongguoLinchmmgKo~gu2005;9(321:135-7(China} 简道林,田玉科吗啡耐受对大鼠脊髓后角星形胶质细胞的影响U1中 国临床康复, 2005,9(32):135—71wwwzglcklcoml 摘要 目的:通过观察口t5啡耐受对大鼠痛行为的影响和脊髓后角胶质细 胞纤 维酸性蛋白阳性产物达的变化,探讨ili{啡耐受对大鼠脊髓后角星形 胶质细胞的影响 方法:实验r2003—11/2004—09在同济医院麻醉研究室完成?造模: SD人鼠l8只,随机分为对照组和nt{啡耐受组,每组9只,在人鼠l背 部纵形切『】,将甜iI聚乙烯导管向,大端插入蛛I删膜下腔2CIll,置管后筇4 天,对照组和i川}耐受组分别经导管注射生理盐水l01和吗啡10p.1 (20g).J次/fI.连续5d?II弓啡耐受坌iI注射I啡后第6灭.鞘内注射II-- IIl}l0L(5Fxg)进行吗啡激发实验观察艰形胶质细胞激活状态: J用免疫组织化h-法观察星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸. 蛋ft染色情况,时计算平均吸光度值和积分吸光度值,表示星形胶质 细胞内胶质纤维酸蛋一表达的强度(A值越人表示胶质纤维酸性蛋白 表达越强)?测定热伤害性缩腿反应潜伏期及非伤害性机械刺激的敏 感程度:置管后第3天分别测定缩腿反应潜伏期和机械性触痛痛阈作 为堆础值.给药第6大吗啡激发试验前测定机械性触痛痫阈,吗啡激发 实验后测定缩腿反应潜伏期,并计算最人镇痛效率. 结果:l8只人鼠均进入结果:管第3天及激发实验前缩足总数 的变化:置管第3天的两组大鼠缩足阳性总次数基本相近『(o.1l?o.33) 次l,第6天?啡激发试验前,对照组的缩足总数变化轻微,而吗啡耐受 组缩足阳性总次数增多f(10.66~1.41)次,(P<0.01)1.(吗啡激发后的 最大镇痛效率:对照组显着高于耐受组I(59.20~4.O0)%,(8.86~1.42)%, (P<0.01)1.(脊髓胶质细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达产物相对面 积,光密度和积分光密度,对照组分别少于吗啡耐受组『3.417~0268比 6530~0.423<00l1,0_357?0.024比0.520土o.025<0.0l1,1689~0303 比2310~0314(P<00l11. 结论:脊髓吗啡耐受导致触诱发痛,激活脊髓后角星形胶质细胞,脊髓 星形胶质细胞可能在吗啡耐受的形成中发挥重要作用. 主题词:吗啡依赖;神经胶质原纤维酸性蛋白质;镇痛 0引言 吗啡在临床上常用于中重度疼痛的镇痛,但长期 使用会产生痛觉过敏和吗啡耐受….近年来的研究认为 吗啡耐受与热痛觉过敏有着相似的病理生理学机制[21. 中枢神经胶质细胞,是一种中枢神经系统免疫细胞,不 仅与神经病理性疼痛,炎性疼痛,癌性疼痛,感染等组 织损伤所致慢性疼痛的产生与维持有关,而且胶质细 胞及其分泌的促炎性细胞因子也可能参与慢性吗啡耐 受的形成1]一l.本实验观察吗啡耐受对大鼠脊髓星形胶 质细胞影响,进一步探讨吗啡耐受的作用机制 1材料和方法 设计:随机对照实验. 单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院麻 醉学教研室. 材料:实验于2003—11/2004—09在同济.医院麻醉 研究室完成.SD雄性大鼠18只,体质量170,250g【来 源于同济医学院实验动物中心,SCXY(鄂)2003—0071, 随机分为对照组和吗啡耐受组,每组各9只.所有大鼠 被饲养在单塑料笼内,室温2O,25?,自由进食和饮 水.光照和无光照时间按12h的周期交替循环. 设计,实施,评估者:为全部作者,均受过专业 培训. 136 IssNi67i一5926CN2i,I470/R zcornkf23385083@sina.com简道林,等吗啡耐受对大鼠脊髓后角星形胶质细胞的影响 方法:参照杨建平等I的方法,行蛛网膜下腔置 管,建立蛛网膜下腔给药途径.将全长17cm,外经 0.3mm左右聚乙稀导管浸泡在乙醇中消毒备用.插管 手术开始前,用生理盐水冲洗导管表面和内腔.动物 清醒后,蛛网膜下腔注人20g/L利多卡因20L,注 药后10S内出现双后肢瘫痪的动物,恢复4d后开始 实验. 麻醉与置管手术过程:10g/L硫喷妥钠40mg/kg 腹腔注射麻醉.大鼠取俯卧位,在L3间隙处作一长 2.5cm的皮肤纵形切口,切开该处背棘肌的筋膜,切断 L棘间韧带,暴露L4与L棘突间隙,再以25G针轻 轻穿破黄韧带,经黄韧带上的破口,将导管插入腰部 蛛网膜下腔2cm.固定导管后,再经皮下隧道将导管 的另一端从颈背部引出. 给药方法:置管后第4天对照组和吗啡耐受组分 别经导管注射生理盐水10L和吗啡10L(20g), 1次/d,连续5d.吗啡耐受组注射吗啡后第6天,经导 管注射吗啡10L(5g),进行吗啡激发试验,观察吗 啡减量后的镇痛效果. 行为学观察:手术置管后第3天分别测定热伤害 性缩腿反应潜伏期和机械性触痛痛阈作为基础值.给 药第6天吗啡激发试验前,测定机械性触痛痛阈.吗 啡激发试验后,测定缩腿反应潜伏期,并计算最大镇 痛效应百分比或最大镇痛效率(注药后的潜伏期,注 药前的潜伏期)xl00/(15一注药前的潜伏期). 缩腿反应潜伏期测定方法:用BME一410A型热痛 测试仪于室温,安静环境下,测定大鼠左后足跖的缩 足潜伏期,每一左后足测3次,间隔5min,取平均值. 最长的热辐射时间设定为15S. 机械性触痛痛阈的测定f6I:将大鼠置于金属网笼 (10cm~10cm~15cm)中,用刺激强度为12g的弗莱 丝,剌激左后跖部表面.弗莱丝剌10次后间隙5min, 重复3遍共30次,记录所诱发的缩足总数,以反应大 鼠对非伤害性机械剌激的敏感程度. 胶质细胞的激活状态:各组于第6天测定机械性 触痛阈后,随机将其中4只大鼠深麻醉后,40g/L的 多聚甲醛溶液灌注固定.300g/L的蔗糖溶液沉底后, 用JungCM1800(Leica)冰冻切片机低温切片,片厚 20m.将组织块连续横断面切片,每只动物各取3张 脊髓片,按胶质纤维酸性蛋白试剂盒说明要求,免 疫组织化学染色.DAB显色,蒸馏水终止显色反应,乙 醇梯度脱水’,透明封固. 每只动物选取3张扫描图像,应用HPIAS一1000 彩色病理图文分析系统软件对胶质纤维酸性蛋白免 疫反应以灰度(采用全屏分割法,取产物染色灰度进 行相对定量分析,即阳性区染色灰度和背景灰度差的 绝对值)来表示阳性反应产物的数量.同时计算平均 光密度值和积分光密度值,表示星形胶质细胞内胶质 纤维酸性蛋白表达的强度(A值越大表示胶质纤维酸 性蛋白表达越强). 主要观察指标:?两组大鼠缩足阳性总数.?两组 大鼠最大镇痛效率.?两组大鼠脊髓后角胶质细胞免 疫组织化学染色观察结果. 统计学分析:数据用x~s表达.由第一作者应用 SPSSl1.0处理,两组间的比较进行t检验,P<0.05认 为差异有显着性意义. 2结果 2.1实验动物数量分析纳入大鼠18只,均进入结 果分析. 2.2两组大鼠吗啡耐受对痛行为的影响置管前的 两组大鼠缩足阳性总数同为(0.1l?0.33)次,第6天吗 啡激发试验前,对照组的缩足总数变化轻微,而吗啡耐 受组缩足阳性总数多达(10.66+1.41)次,提示慢性吗啡 耐受导致大鼠产生了机械性痛觉超敏.吗啡激发后的最 大镇痛效率,对照组最大镇痛效率为(59.20~4.oo)%,显 着高于吗啡耐受组(8.86~1.42)%(P<0.01). 2-3两组大鼠脊髓后角胶质细胞免疫组织化学染色 观察对照组脊髓胶质细胞的胞体和突起染色轻淡, 见图1,而吗啡耐受组胶质细胞胞体和突起染色较对 照组明显加深,表现为胞体增生肥大,细胞突起也明显 增粗,见图2,说明胶质细胞被激活而增生.脊髓胶质细 胞的胶质纤维酸性蛋白阳性表达产物相对面积胶质纤 维酸性蛋白阳性,光密度和积分光密度,对照组和吗啡 耐受组分别是3.417?0.268和6.530-+0.423<0.O1), 0.357~0.024和0.520~0.025(P<0.01),1.689~0.303和 2.310~0.314(P<0.01). 3讨论 本实验结果表明,鞘内反复应用吗啡,导致吗啡抗 伤害性效果降低,形成吗啡耐受,诱发痛觉超敏,激活 脊髓后角星形胶质细胞,激活的胶质细胞能分泌多种 神经活性物质,对吗啡耐受和痛觉过敏的产生与维持 有着密切关系_3,71. 吗啡耐受在脊髓水平的发生机制与痛觉过敏相 似_2】’9】.神经损伤产生的伤害性信息,主要激活脊髓后 角I,?板层内侧部的神经元.长期应用吗啡引起吗 啡耐受时,这些神经元的代谢也发生改变.吗啡耐受和 神经损伤的伤害性传人,均可引起神经元内信号转导 分子蛋白激酶C活性增强和一氧化氮含量增多.因 此,脊髓后角二级神经元是热痛觉过敏和吗啡耐受产 生的关键部位.在神经元上,阿片受体可分为,8和 K3种亚型,吗啡主要作用于受体.受体为G蛋白 偶联受体,其被激活后可通过磷酯酶C途径使蛋白激 酶C活性增强,同时引起细胞内的Caz榷度增加.此时 细胞内Ca+增加有两方面的原因,其一为IP3引起肌 ISSN1671—5926CN21—1470/1tt—z中国临床康复2005年8月28 日第9卷第32期 浆网释ca入胞浆,其二为蛋白激酶C的激活可进一 步促进细胞外Ca2内流.蛋白激酶C促进Ca2内流的 作用是通过N一甲基一D一天冬氨酸受体所介导的f】Ol.胞 浆内Ca2浓度增加同样也会使一氧化氮合酶活性增 强,一氧化氮生成增多.吗啡作用于阿片受体,兴奋 阿片受体与伤害性剌激传人时释放兴奋性氨基酸并 兴奋N一甲基一D一天冬氨酸受体不同,但同样引起蛋白 激酶C激活和一氧化氮生成增多,并参与吗啡耐受的 形成. 近来的许多研究表明,胶质细胞的激活在病理性 痛的产生和维持中发挥重要作用.皮下注入炎性物 质,腹腔注入细菌,周围神经创伤,骨癌,腰脊神经根 结扎等疼痛刺激,激活胶质细胞,出现星形胶质细胞 特异性标识物胶质纤维酸性蛋白和小胶质细胞特异 性标识物补体C3受体的表达增多,影响胶质细胞功 能的药物能产生明显的镇痛作用ol,慢性脊髓注射吗 啡导致吗啡耐受时,脊髓背角星形胶质细胞被激活, 胶质细胞的体积增大,胶质纤维酸性蛋白表达明显增 加.提示胶质细胞的激活与吗啡耐受同样密切相关, 这与Song和ZhaoBll的研究结果相似.结果提示在吗 啡耐受时.在胶质细胞内也可能存在与神经损伤所致 痛觉过敏相类似的病理生理学机制. 吗啡耐受时胶质细胞为什么被激活,其机制尚不 清楚.吗啡与细胞因子具有许多相同的特征,内源性 阿片肽现在被认为是细胞因子家族的成员.胶质细胞 作为一种免疫样的细胞也存在着阿片受体.吗啡直接 作用于胶质细胞,导致胶质细胞的代谢,形态学及其 功能发生变化.由于胶质细胞是吗啡重要的作用靶细 胞,胶质细胞可能是吗啡依赖形成的关键介导因素. 吗啡作用于胶质细胞,也可能发生在神经元内一样的 代谢过程,从而使胶质细胞激活.在哺乳动物有胶质 细胞上存在阿片受体与一氧化氮的释放相关联,而一 氧化氮的释放在吗啡耐受的形成中发挥重要作用.这 一 机制至少部分参与介导了吗啡慢性给药时可引起 的中枢可塑性变化. Hauser等『I21报道,吗啡对星形胶质细胞影响,它经 受体,通过Ca2+.依赖Ca释放,增加细胞内Ca2,影 响胶质细胞的发育,虽然抑制DNA的合成,但同时促 进胞浆合成而使胶质细胞肥大而被激活. 胶质细胞通过某些间接的途径,也调节神经元的 可塑性变化.胶质细胞摄取诸如参与吗啡耐受形成的 氨基丁酸,谷氨酸等氨基酸神经介质.胶质细胞产生一 氧化氮,环氧化酶物质,引起中枢神经系统突触传递功 能的长时程变化.抑制这类物质的产生,可以减轻吗啡 耐受的形成.反复地给予吗啡,可能影响到吗啡与神经 137 递质受体之间,吗啡和摄取转运体与第二信使系统之 间的相互作用,胶质细胞也参与控制这些作用【I’I. 不管是外周还是中枢给予白细胞介素lB,白细 胞介素6和肿瘤坏死因子,均可诱发大鼠疼痛过敏 和机械性痛敏’I.Raffa等棚推测细胞因子能与阿片受 体相互作用而调节阿片受体.原代小胶质细胞存在吗 啡受体,吗啡能促进肿瘤坏死因子增多,提示吗啡 对胶质细胞有直接作用.吗啡促进猪和人小胶质细胞 产生肿瘤坏死因子.外周给予可溶性肿瘤坏死因子 受体部分恢复神经根切断大鼠吗啡的急性抗伤害性效 应[】41.慢性吗啡处理所导致的促炎性细胞因子免疫反 应的激活,也可能涉及到丝裂原活化蛋白激酶或蛋白 激酶C通路,这两种酶在导致吗啡耐受形成,神经病 理性疼痛及其促炎性免疫反应的胞内信号传导级联反 应中,发挥着关键性的作用[21. 临床上反复给予吗啡,导致吗啡痛镇痛作用降低, 同时发生耐受相关的痛觉过敏.为了发挥镇痛效应,必 须增加吗啡用量,但反过来又可使痛觉过敏加重,由此 而形成一个恶性循环,而且大量的吗啡必然产生许多 不良反应.由于吗啡本身是一种细胞因子,胶质细胞 是一种免疫细胞,激活的胶质细胞又释放促炎性细胞 因子等致痛物质.研究胶质细胞在吗啡耐受中的作用 及其机制,以及吗啡耐受和依赖与免疫因素的关系, 为寻求减缓吗啡耐受和防治吗啡依赖,提供了一种新 的思路. r图1,2见封三) 4参考文献 lChristensenD,KayserVThedevelopmentofpain?relatedbehaviourand opioidtoleranceafterneuropathy-inducingsurgeryandshamsurgery.Pain 2000;88(3):23l一8 2MaoJ,PriceDD.MayerDJ.Mechanismsofhyperalgesiaandmorphine tolerance:acurrentviewoftheirpossibleinteractions.Pain1995;62(3):259-7 4 3Wieseler-FrankJ,MaterSF,WatkinsLRGlialactivationandpathological pain.NearochemIra2004;45(2-3):389-95 4WatkinsLR.MilliganED.MaterSF.Spinalcordglia:newplayersinpain.Pain 2OOl;93(3):2Ol一5 5饧建半,蒋豪,吴珏.大鼠蛛网膜下腔埋管井长期埋管并长期留置操 作的改 进[J】.中华麻醉学杂志,1993,13(2):llO一2 6ColbumRW.RickmanAJ.DeLeoJATheeffectofsiteandtypeofnerve injuryonspinalsli-~activationandneuropathicpainbehavior.ExpNearol 1999;157(2):289—304 7RaghavendraV,TangaF,RutkowskiMD,eto1.Anti-hyperalgesicand morphine-sparingactionsofpropentofyllinefollowingperipheralnerveinjuryin rats:mechanisticimplicationsofspinalgliaandproinflammatorycytokines. 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