恒河猴纹状体一氧化氮合酶阳性神经元的形态学观察

恒河猴纹状体一氧化氮合酶阳性神经元的形态学观察 Vol . 31 No . 3 第 31 卷第 3 期 郑州牧业工程高等与科学校学报 2 0 1 1 年 8 月J o ur nal of Zhengzho u College of A ni mal H u sba ndr y Engi nee ri ng A ugu st 2011 恒河猴纹状体一氧化氮合酶阳性神经元 的形态学观察 1 2 3 2 3 3王平利,程树军,李玉谷,黄 韧,张 媛,李楚宣 (11 河南农业大学 牧医工程学院 ,河南 郑州 450002 ;21 广东省实验动物监测所 , ) 广东 广州 510260 ;31 华南农业大学 兽医学院 ,广东 广州 510642 摘要 : 为研究恒河猴纹状体一氧化氮合酶阳性神经元的形态特征和分布特点 ,利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄 ( ) ( ) 递酶 N AD P H - d组织化学和神经元型一氧化氮合酶 nNO S免疫组织化学法 。结果发现尾壳核内分布着大量形态 μ多样的 N AD P H - d 和 nNO S 阳性神经元 ,其胞体呈锥体形 、多角形 、纺锤形 、梭形和卵囿形 ,直径 91 6～271 2 m 。在 μ内囊中有少量的阳性细胞 ,形态多样 。外髓板中有淡染的 N AD P H - d 、nNO S 弱阳性大细胞 ,直径 271 2～541 4 m 。 恒河猴纹状体内有大量的形态大小不一的一氧化氮合酶阳性神经元 。 关键词 : 一氧化氮合酶阳性神经元 ; 纹状体 ; 恒河猴 () 中图分类号 : R338 文献标识码 : A 文章编号 :100823111 20110320006204 Morphological Observat ion of the Neurons Conta in ing NOS in the Striatum of Rhesus Mon key( Macaca Mulatta) 1 2 3 2 3 3WA N G Pi ng2li, C H EN G Sh u2j un,L I Yu2gu, H U A N G Re n, Z HA N G Yua n, L I Ch u2xua n (11 College of H usba nder y a nd Veterina r y Engineering of Hena n A gricult ure U niver sit y , Zhengzho u Henan 450002 ,China ; 21 Guangdo ng L a bo rato r y A nimal Mo nito ring Instit ute , Gua ngzho u 510260 , China ; )31 College of Veterinar y Medicine , So ut h China A gricult ure U niver sit y , Guangzho u 510642 , China Abstract : To st udy t he cha racteri stic s of mo rp holo gy a nd di st ributio n of neuro ns co ntaining nNO S in t he st riat um of ( ) r hesus mo nkey1 Nico tina mide adeni ne dinucleo tide p ho sp hate diap ho ra se N AD P H - dhi stochemical a nd neuro nal nit ric ( ) o xide synt ha se nNO Simmuno hi stochemical reactio n1 A lo t of po sitive neuro ns fo r N AD P H - d o r nNO S scat tered i n μt he caudate - p ut men nucleus1 They were p yra midal , multia ngula r , spindle , f usifo r m , o val shap e , a nd 91 6,271 2 m in dia met er1 A f ew of po sitive neuro ns in diff erent shape al so located in inter nal cap sule1 In exter nal and inter nal me2 dulla la mina of glo bus pallidus , po sitive neuro ns st rictl y exi sted in t he lamina1 Several gro up s of mo derat ely po sitive la r ge cell s fo r bo t h N AD P H - d a nd nNO S di st ributed in t he exter nal medulla la mina1 Lo t s of NO S - po sitive neuro ns i n diff erent shape a nd size exi sted in st riat um of r he sus mo nkey1 ( )Key Words : NO S - po sitive neuro ns ; St riat um ; Rhesus mo nkey Macaca M ulat ta ( ) 广泛存在于哺乳动物的神经系统 、心血管系统 、免疫一氧化氮 nit rico xide , NO是一种最新发现的 、 哺乳动物中最小 、最轻幵具有独特理化性质和生物学 系统 、消化系统和生殖系统等 。因为 NO 的半衰期徆 [ 1 ] ( 短 活性的信息和效应分子。在一氧化氮合酶 nit ric ,难 以 直 接 测 定 , 但 可 通 过 测 定 一 氧 化 氮 合 酶 () ) ( o xide aynt hase ,NOS的作用下 ,以还原型辅酶?nico2 NOS,间接反映 NO 的量 。最近研究证明 ,NADP H [ 2 ] tinamide adenine dinucleotide p ho sp hate diap horase , - d 就是一种一氧化氮合酶。为研究 nNOS 及其 ) NADP H - d、四氢叴酸 、黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素 阳性神经元在中枢神经系统疾病的致病机理和变化 , 单核苷酸作为辅酶 ,由 L - 精氨酸末端的胍基原子团 寻找有效的防御 、治疗措施 ,非人灵长类被广泛用作 生成 。目前发现机体内有 3 种类型的 NOS ,包括神经 疾病模型 ,其中恒河猴是应用最广 、也是最理想的实 [ 3 ] ( ) () () 元型 nNOS、内皮型 eNOS和诱导型 iNOS。NOS 验动物。目前 ,国内还没有关于恒河猴纹状体一氧 收稿日期 :2011207218 ) (作者简介 :王平利 1976 ,女 ,河南濮阳人 ,硕士 ,讲师 。 ( ) 化氮合酶阳性神经元分布的报道 。本文采用 NAD2 Sigma 公叶,37 ?,30 min ; 01 01M PBS 洗 5 min × ) ( P H - d 组织化学和 nNOS 免疫组织化学法在这方面 3 ;01 05 %DAB 华 美 生 物 工 程 有 限 公 叶+ 01 03 % 作了初步的研究 。 HO液显色 ,镜下控制 ;裱片 ,烤干 ,二甲苯透明 ,中2 2 性树胶封片 。Olymp us 显微镜观察和摄影 。 1 材料与方法 2 结果 11 1 实验动物 成年恒河猴 3 只 ,购自华南濒危动 尾壳核中有大量深染的 NOS 阳性神经元 ,NAD2 物研究所实验猴厂 ,雄性 ,年龄分别为 4 、6 、6 岁 。大 笼饲养 ,饲养条件符合国家有关标准 。动物经检疫排 P H - d 组化反应呈深蓝色 ,nNOS 免疫组化呈棕黄色除沙门氏菌 、志贺氏菌 、结核杆菌和 B 病毒感染 ,外观 () 图 1 ,图 2。胞体呈锥体形 、多角形 、纺锤形 、梭形和 正常 ,质量符合国家实验动物普通级标准 。动物质量 卵囿形 ,阳性反应产物在胞质中均匀分布 ,有的反应 合格证 :粤检证字 2001A010 。动物处死前禁食不禁 产物将胞核覆盖 ,有的胞核显露出来 ,胞核阴性 。各 水 12 h 。 种形态的神经元的突起及其分支也为强阳性 ,突起上 有膨体 ,呈深蓝色和棕黄色 。锥体形和多角形细胞的 11 2 动物取材和固定 恒河猴经氯胺酮麻醉后 ,仰 μ胞体大 ,直径为 191 2～271 2 m ;纺锤形 、梭形和卵囿 卧保定 。开胸经左心室升主动脉插管 ,剪开右心房 , μ形细胞为中等大小 ,直径为 91 6～131 6 m ,数量比锥 01 9 %生理盐水灌洗 ,至右心房流出液体为淡红或无 体形和多角形细胞数量多 。阳性神经元在尾壳核中 () 色 。接着用 4 ?4 %多聚甲醛 PBS 01 1M ,p H71 4先 分散分布 ,没有区域性密度差异 。在尾壳核的灰质索 快速灌注固定 15 min ,以迅速达到初步固定 ,然后慢 (中有阳性神经元 ,形态和大小不尾壳核本部相似 图 灌 30 min 以上 ,使组织充分固定 。灌注结束后 ,快速 ) 3。大量深蓝色 、棕黄色阳性点状结构弥散分布于尾 ( ) 开颅 取 脑 , 置 于 4 % 多 聚 甲 醛 PBS 01 1M , p H71 4 壳核及其灰质索中 。在尾壳核的内囊中有少量的阳 10 min 。然后将大脑由大脑裂处切开 ,分为左右两部 ( 性细胞 ,中等大小 ,呈锥体形 、梭形和卵囿形 ,反应产 分 ,按照恒河猴脑立体图谱 Richard F Martin , Do ug2 物均匀分布于胞质和突起中 。内囊中没有阳性深蓝 las M Bewden1 Primate Brain Map s : St ruct ure of t he ) Macaque Brain,冝状切取大脑 ,3～5 mm 厚 。置于相 色 、棕黄色阳性点状结构分布 。同固定液 4 ?冞箱后固定 8 h ,放入 15 %、20 %、30 % () 01 1M PBS 蔗糖溶液 p H71 4中 ,浸泡至组织块沉底 。 μLeica 恒冷箱冞冻切片机连续切片 ,片厚 40 m ,01 1M PBS 接片 。取相邻切片分别进行如下染色 :一套进行 nNOS 免疫组织化学染色 ; 一套进行 NADP H - d 组 织化学染色 。 11 3 NADP H - d 组织化学染色 用 01 1 mol/ L PBS () p H71 4 ～ 71 6 洗 片 2 次 , 放 入 孵 育 液 中 , 37 ? β)( 5～6 h 。孵育液为 :1 mg/ mL- NADP H Sigma 公叶 (+ 01 1 mg/ mL NB T 氯化硝基茎四氮唑蓝 ,上海前进 ) () 化学试剂厂+ PBS 01 1M ,p H71 4+ 01 3 % Trito n X 图 1 尾壳核卵圆形阳性神经元 () β- 100 华美生物工程有限公叶。阴性对照不加- nNO S 免疫组化染色 10 ×10NADP H 。01 1 mol/ L PBS 液终止反应 ,梯度酒精脱 水 ,二甲苯透明 ,中性树胶封片 。Olymp us 显微镜观 察和摄影 。 11 4 nNOS 免疫组织化学染色 用 01 01M PBS 洗 ( 片 ,5 min ×2 ; 滴加内源性过氧化物酶阻断剂 试剂 ) A ,武汉博士德生物工程有限公叶;01 1 M PBS 浸洗 (5 min ×3 ;滴加非免疫动物血清 试剂 B ,武汉博士德 ) (生物工程有限公叶,室温 1 h ;加 nNOS 一抗 1 ?500 ) (稀释 ,Sigma 公叶,4 ?冞箱过夜 阴性对照不加一 ) 抗;用 01 01M PBS 浸洗 5 min ×3 ;加生物素化二抗 () 试剂 C ,武汉博士德生物工程有限公叶,37 ?孵育 图 2 尾壳核阳性神经元 1 h ;用 01 01M PBS 浸洗 5 min ×3 ;滴加 ABC 复合物 N AD P H - d 组化染色 10 ×40 8 郑州牧业工程高等与科学校学报 第 31 卷 探讨了 N O 在纹状体生理病理活动中的作用 。结果 显示各部位的毛细血管内皮细胞 N AD P H - d 组化 反应呈阳 性 , nN O S 免 疫组 化反 应 呈 阴 性 。N AD2 P H - d 组化反应可显示 3 种类型的 N O S ,而 nN O S 免疫组化反应仅特异显示 nN O S ,毛细血管内皮细 ( ) 胞含有内皮型 N O S eN O S,本试验中显示的均为 nN O S 。本研究表明 , 恒河猴尾壳核分布有大量的 N O S 阳性神经元 ,呈锥体形 、梭形和纺锤形等 ,以中 [ 5 ] [ 6 ] 等大小神经元居多 。在大鼠、小鼠等也有类似 的报道 。Meyner t 基底核的胆碱能神经纤维投射到 [ 7 ] 图 3 尾状核灰质索阳性神经元 纹状体 。据 Smiley 报道,纹状体内个体较大的神 nNO S 免疫组化染色 10 ×10( ) 经元含有 乙酰 胆碱 转 移酶 ChA T和 毒 蕈 碱 受 体 壳核不外侧苍白球之间的外髓板中有淡染的 ( ) M2 受体,约占 M 型受体阳性神经元的 60 % ; 中 ( ) N O S 弱阳性大细 胞 图 4 。8 ～ 10 个细 胞 形成 一 等大小的 N O S 阳性神经元不 M 受体共存 ,属于非 簇 ,沿着外髓板成纵行排列 ,也有呈单个分布 。胞体 棘突的中间神经元 ,不含 ChA T ,约占 M 型受体阳 μ呈卵囿形 ,直径为 271 2～381 5 m ,比相邻壳核中的 性神经元的 40 % 。在本试验中 ,发现恒河猴尾壳核 阳性 细 胞 大 。N AD P H - d 组 化 反 应 呈 淡 蓝 色 , μ内含有胞体直径为 191 2 ～271 2m 的阳性神经元 , nN O S 免疫组化反应呈淡黄色 ,反应产物均匀分布 可能是所报道的含有 ChA T 的神经元 。这些研究 于胞质中 ,胞核位于一侧 ,呈阴性 ,突起不明显 ,弱阳 表明 ,纹状体的胆碱能系统不硝基能系统相互协调 , 性反应 。未见蓝色和棕黄色的点状结构 。内 、外苍 相互影响 ,有机地调控机体的生命活动 。另有研究 [ 8 ] 白球之间的内髓板中有深蓝色和棕黄色 N O S 阳性 表明,尾壳核内的 nN O S 、N AD P H - d 阳性神经 细胞 ,数量较少 , 呈梭形 、锥体形和纺锤形 , 中等大 ( ) ( ( ) 元不生长抑素 SS、神经肽 Y N P Y、5 - 羟色胺 5 μ小 ,直径为 91 6～131 6 m ,突起明显 ,呈阳性 。 ) - T H等递质共存 。纹状体的 nN O S 神经元同时 ) ) ((含有 Ac h 乙酰胆碱、SS 、N P Y、DA 多巴胺和 5 - T H 等神经递质 ,表明纹状体的功能网络是复杂多 样的 ,同时 N O 不多种递质相互影响 ,发挥着广泛的 调节功能 。在中枢神经系统 , nN O S 阳性神经元产 生的 N O 作为神经递质和第二信使起着广泛的作 用 ,调节脑血液循环 、神经元发育 、轴突生长 、突触建 立和修饰 等过 程 。N O 不 经 典 递 质 的 传 递 过 程 不 同 ,N O 合成后幵不储存于突触小泡内 ,也没有与门 的 N O 受体 ,而以扩散的方式到达邻近靶细胞 。这 种逆行信使的性质使 N O 在信叵传递中起特殊的作 用 。本试验发现 , N AD P H - d 组化和 nN O S 免 疫 图 4 外髓板内阳性大细胞 组化反应产物均匀分布于神经元的胞质和突起中 , N AD P H - d 组化染色 10 ×40 幵有大量深蓝色 、棕黄色阳性点状结构弥散分布于 各部位的毛细血管内皮细胞 N AD P H -d 组化 尾壳核及其灰质索中 ,可能是神经元突起的横断面 , 反应呈阳性 ,nN O S 免疫组化反应呈阴性 。这从形态学方面证明了 nN O S 产生的 N O 通过扩散 的方式不各种神经递质相互作用 ,调节着各种神经 讨论3 生理和病理活动 。 用 N AD P H - d 酶组织化学技术是简单可靠的 本试验观察到 , 恒河猴内囊中分布有 N O S 阳 [ 4 ] 显示 N O S 的方法。结合免疫组织化学方法 ,更特 性神经元 ,中等大小 ,呈锥体形 、梭形等 ,突起及分支 异 、准确地显示 N O S 的活性和分布特征 , 揭示 N O 明显 。笔 者 在 恒 河 猴 大 脑 皮 层 下 的 髓 质 发 现 有 在各部位的作用 。本试验采用 N AD P H - d 组织化 N O S 阳性神经元 ,因为内囊是从大脑皮质来源的髓 学和 nN O S 免疫组织化学方法 ,研究了恒河猴大脑 质纤维 ,推测内囊中的阳性神经元来源于大脑皮层 纹状体 N O S 阳性神经元的形态和分布特征 , 初步 下髓质 ,不髓质中的阳性神经元是同一类型 ,属于间 [ 9 ] t ha se p ro tein a nd mRN A a re di scretely locaoized in 质神经元 。而刘曾旭等则报道 ,在大鼠的内囊中 neuro nal pop ulatio ns of t he mammalia n CN S to get her 未见 N AD P H - d 、nN O S 阳性神经元 , 不本试验的 ( ) wit h N AD P H - diap ho ra se [ J ]1 Neuro n , 1991 , 7 5: 结果不同 。在本试验中 ,内囊中没有发现深蓝色和 615 - 6241 棕黄色的点状结构 ,这可能不内囊中的神经元数量Mer rill DA , Ro bert s J A , Tuszynski M H1 Co nserva2 [ 3 ] 少 ,突起及 其 分支 少有 关 。恒 河 猴 内 囊 中 的 N O Stio n of neuro n number a nd size in enter hinal co rtext layer s ?, ? a nd ?/ ? of aged p rimates [ J ] 1 Co np 阳性神经元的生理作用有待于进一步研究 。 本试() Neurol , 2000 , 422 3:386 - 4011 验发现 ,恒河猴壳核不苍白球交界处的外 Scherer S , Vindent SR , Ki mr ua H1 Demo nst ratio n fo r [ 4 ] 髓板中 ,有呈特殊弱阳性着色的细胞簇 ,其胞体大 , a unique pop ulatio n of neuro ns wit h N AD P H - diap ho2 不见突起 ,几簇细胞团沿着外髓板成纵行排列 。目 ra se hi stochemi st r y [ J ]1 Neuro science Met ho d , 1983 , () 9 2:2291 前还没有关于这种细胞的报道 ,对其类型和生理功 [ 10 ] [ 5 ] 傅文玉 ,张进禄 ,黄 岩 ,等. 帕金森病大鼠黑质和纹状 能有待于进一步研究 。Ro dri go 报道,在大鼠苍 ( ) 体神经元的变化 [ J ]1 解剖科学进展 , 1997 , 3 3 : 208 白球的内髓板中分布有 N O S 阳性神经元 。本试验 - 2121 发现恒河猴内髓板也分布有 N O S 阳性神经元 , 中 [ 6 ] 谢兴国 ,蔡文琴 ,张吉强 ,等. 一氧化氮合酶阳性神经元 等大小 ,呈锥体形 、梭形等 ,其功能有待于深入研究 。 ( ) 在小鼠脑内的分布 [ J ]1 解剖学杂志 , 2002 , 25 1: 47 - 501 本研究观察了正常恒河猴纹状体 N O S 阳性神 [ 11 ] [ 7 ] Smiley J F , L evey A I , Me sulam M M1 M2 - musca rinic 经元的形态和大小 。史玉泉等报道指出 ,脑血管 recep to r s immunolocalizatio n in choliner gic cell s of t he 病变作为继发性帕金森氏病和其它锥体外系疾病的 mo nkey ba sal fo rebrain a nd st riat um [ J ] 1 Neuro2 病因之一 ,以缺血后纹状体和黑质变性为主 。朱新 () science , 1999 , 90 4:803 - 8141 [ 12 ] [ 8 ] J o hn F Smiley , J o hn P Mc Ginni s , Daniel C J avit t1 Ni2 平等发现 ,脑缺血再灌注过程中 nN O S 神经元在 t ric o xide synt ha se in t he mo nkey cerebral co rtex a re 不同阶段的受损程度不同 ,早期细胞数量减少 ,形态 subset s if t he so mato statin , neurop ep tide Y , and cal bi2 萎缩 ,树突缩短 ;中期一过性升高 ,随后 nN O S 神经 ndin cell s [J ]1 Brain Reaearch , 2000 , 863 , 205 - 2121 元明显减 少 , 胞 体 浓 缩 、崩 解 , 树 突 消 失 。纹 状 体 [ 9 ] 刘曾旭 ,熊树明 1 大鼠大脑半球髓质及基底核内一氧 nN O S 损伤后恢复徆慢 ,影响了纹状体对锥体外系 ( ) 化氮合酶的分布 [J ] . 江西医学院学报 ,1999 ,39 4: 11 - 131 ( 的功能调节 ,增加了患帕金森氏病 Pa r ki n so n’ s di s2 [ 10 ] Ro drigo J , Sp ringall D R , U t tent hal O1 Localizatio n ( ) ) ea se , PD、亨廷顿氏病 H unti ngto n’ s di sea se , HDof nit ric o xide in t he adult rat brain[J ]1 Philo s Tra ns [ 13 ] 的危险系数 。Ya ma da 等研究报道 ,老年大鼠纹 () R Soc Lo nd B Biol Sci , 1994 , 345 2:175 - 2111 史状体 N O S 免疫反应阳性细胞数目大量下降 , 树突 [ 11 ] 玉泉 ,周孝达 ,汪无级 ,等. 实用神经病学 [ M ] . 第 2 分支数目减少 ,长度变短 , N AD P H - d 阳性细胞减 版. 上海 :上海科技出版社 ,19951 [ 12 ] 朱新平 ,刘才栋 ,顾红玉 ,等 . 大鼠局灶性脑缺血 - 再 少 。PD 病人纹状体的 N AD P H - d 阳性细胞数目 灌注后尾壳核神经型一氧化氮合酶表达的变化 [ J ]1 [ 14 ] 大 量 下 降。研 究 表 明 尾 状 核 和 壳 核 神 经 元 () 解剖学杂志 ,2001 ,24 5:429 - 4331 nN O S 的 m RN A 在 HD 病人中大量丢失 ,不病的严 [ 13 ] Yamada K , Ko mo ri Y , Sugiha ra H1 Reductio n in t he [ 15 ] [ 16 ] 重性呈正 相关。Pea rce 等报 道 , 在 阿 尔 茨 海 number of N AD P H - diap ho ra se - po sitive cell s in t he cerebral co rtex and st riat um in aged rat s [ J ] 1 ( ) 默氏病 Alzhei me r’ s di sea se , AD ,老年性痴呆、HD () Neuro science Res , 1996 , 24 2:393 - 4021 病人的大脑皮 质 和纹 状体 , nN O S 、N AD P H - d 阳 Bockel ma nn R , Wolf G , Ra nsmayr G1 N AD P H - di2 [ 14 ] 性神经元被选择性地保留下来 ,推测在正常的基础 ap ho ra se/ nit ric o xide synt ha se co ntaining neuro ns in 代谢过程中产生 N O 的 N O S 阳性神经元具有特异 mo r mal a nd Pa r kinso n’ s di sea se p uta men [ J ]1 Neural 的保护系统 ,抵抗 N O 介导的兴奋性氨基酸的细胞 Transm : Par kinso n’ s Di sea se Dementia Sect , 1994 , 7 () 1:115 - 1211 毒性 。关于老年及各种疾病模型恒河猴纹状体内 No r ri s PJ , Waldvo gel HJ , Fa ull RL1 Decrea sed neu2 [ 15 ] N O S 阳性神经元及 nN O S 的形态 、大小和数量的变 ro nal nit ric o xide synt ha se messenger RN A a nd so ma2 化 ,还有待于进一步深入研究 。本文为以后相关部 to statin me ssenger RN A in t he st riat um of H unting2 位的疾病模型以及功能研究提供了形态学资料 。 ( ) to n’s di sea se [J ]1 Neuro science , 1996 , 72 4: 1037 - 10471 [ 16 ] Pea rce B R , Pal mer A M , Bo wen DM1 Neuro t ra nsmit2 参考文献 : ter dysf unctio n a nd at rop hy of t he caudate nucleus in [ 1 ] Synder S H , Bredt DS1 Nit ric o xide a s a neuro nal me s2 Al xheimer’s di seaa se [J ]1 Neurochem Pat hol , 1984 , 2 () senger [J ]1 Trend Pham Sci , 1991 , 12 12:1251 () 2:221 - 2321 [ 2 ] B redt DS , Glat t C E , Hwang PM1 Nit ric o xide syn2