hCG—β反义寡脱氧核苷酸对人绒癌JAR细胞hCG分泌作？…

hCG—β反义寡脱氧核苷酸对人绒癌JAR细胞hCG分泌作？… hCG—β反义寡脱氧核苷酸对人绒癌JAR 细胞hCG分泌作,… 2一2口 第29卷第5期 2O00年 浙江大学(医学版) joURNALOFZHEJIANGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES) V0J29No5 2000 hCG一反义寡脱氧核苷酸对人绒癌JAR细胞 hCG分泌作用的研究 L— ,,襄俭 浙江大学医学院附属妇产科医院,浙江杭州310006) 摘要:目的:探讨人绒毛膜促性腺激素一口反义寡脱氧核苷酸(hCG一口AS—ODN)抑制JAR绒癌细 胞株hCG的分泌.方法:设计hCG一口mRNA的AS—ODN,作用于体外培养的JAR绒癌细胞株,细 胞浓度为1×10/个.ODN的浓度分别为5]*mol/L,10~mol/L,20t~mol/L与JAR细胞共培养在 96孔培养板中,24h,48h,72h和95h,取上清测hCG—p含量.结果:10m0J,/L浓度的hCG一口AS— ODN对JAR细胞在悼外作用24h,hCG邛分泌呈下降趋势,48h下降达57,此后,抑制作用略 有减弱,而20mol/L的正义和随机的ODN,分泌也受抑制.结论:5,10ttmol/L的As—ODN明 显抑制体外培养的hCG分泌细胞hCG蛋白的分泌,且该AS—ODN有希望作为 hCG分泌抑制物应 用.^C,0驯 关键词:寡核苷酸类,反义/药理学;绒毛膜癌;JAR细胞株;绒毛膜促,f腺激素,亚基t 人 中图分类号}R969文献标识码;A文章编号:1008—9292(2000)05—0203—04 EffectsofAntisense0ligodeoxynucleotidesofhCG—ponProductionof hCGbvJARCellsinVitro CHENYuan—yue,LUShi— ming,QIUJian.(Obstet*.icsandGynecologyHospital,CollegeofMedical Sciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou,310008,China) Abstract:Objective:Toobservetheinhibitioneffectofantisenseoligodeoxynucleotides(AS- ODN)ofhCG—BonhCGsecretionbyJARceils.Methods:AAS一 0DNwassynthesizedinacoor— dancewiththemRNAofthehCGsubunit.ThehumanchorioniccarcinomacelllineJARwas usedforresearch.Theterminalconcentrationofthecellsuspensionwas1× 10cell/m1.TheSUS— pensionforeachwellcontaining5t~mol,/L,10vmol/Land20i~mol/Lantisenserespectivelywere addedto96wellmicrotitrecultureplate.culturedfor24h,48h,72hand96h.Thesupernatants werecollectedfordetectinghCG一臣Results:Theconcentrationof10/*mol/LAS— ODNofhCG一口 causedasignificantinhibitionofsecretinghCGbyJARceilsin24hcultureinvitro.Theinhibi— tionratereachedto57andbegantOdeclineafter48h.Whentheconcentrationreachedto20 umol/L,bothsenseandrandomODNshowedasignificantinhibitiononsecretenofhCG一臣 Con— clusion:Theconcentrationsof5,10v.mol/LAS—ODNofhCG— Bcausedsignificantinhibitionof HCGproductionofhCG—secretion—cellculturedinvitro.theAS— ODNofhCG-13maybeusedasa inhibitorofhCGsecretion. Keywords:Oligonucleotides,antisense/pharmacol;Choriocarcinoma;JARceil;Chorioni cgon odotropin,betasubunit,human 人绒毛膜促性腺激素(hCG)是由滋养细胞 台成和分泌的一种糖蛋白激素.反义核酸即指 根据碱基互补原理,用人工合成或生物体合成 收稿日期:1999-12—14謦同日期:2000-07—09 基金资助;浙江省卫生厅科学基金资助项目 作者简介:陈援~(1965--),女.硬士,主治医师,从事妇产科 204浙江大学(医学版)第29卷 临床医学. 的特定互补的DNA或RNA序列导八靶细胞, 形成inRNA—DNA或illRNA—RNA杂交双链, 从而抑制或封闭特定或相关基因的表达口] hCG是由和B两个亚基组成,若阻断其B亚 基就有可能阻止完整的hCG分子的生成,本研 究设计hCG—BmRNA15个碱基的反义寡脱氧 核苷酸(As_ODN),经硫代磷酸修饰,作用于 hCG分泌细胞一JAR绒癌细胞株,观察AS— ODN抑制hCG分泌的起效时间,作用效率,反 应浓度及对该细胞生长的影响,期为控制 hCG分泌的反义技术的应用奠定实验基础. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1主要试剂:hCG—B特异的反义,正义和 随机寡脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotide, ODN)序列设计参阅文献报道L2],由上海生工 生物工程公司合成.反义序列:5'-CTGGAA CATCTCCAT一3,正义序列(S一0DN):5一 ATGGAGATGTTCCAG一,随机(R一 0DN)序列:5NNNNNNNNNNNNNNN一3 hCG—B放射免疫分析试剂盒为上海放射免疫分 析技术研究所产品. 1.1.2细胞系:人绒癌JAR细胞株由中科院 上海细胞所细胞库提供,常规培养于含10小 牛血清的RIMP1640培养液中实验用细胞均 处于指数生长期. 1,2方法 1.2.1AS一0DN不同时间处理JAR细胞: JAR细胞悬于含lO小牛血清RIMP1640液 中,以1×10个/ml,2001/孔接种于96孔板, 37?过夜,每组重复3孔实验分组(1)AS— ODN组:过夜24h加AS—ODN(溶于0.9生 理盐水)先取上清1001,补加1001培养液 (含AS一0DN终浓度10~tmol/L).开始取上清 的时间又分为加AS—ODN24h,48h,72h后, 方法同上所述,各每隔24h重复一次,至96h 止;(2)对照组:方法同AS-ODN组,加药改为 加同体积的0.9生理盐水;(3)正义组:方法 同AS-ODN组;(4)随机组:方法同AS一0DN 组.取出上清分别贮于一2O?保存待测. 1.2.2不同浓度AS—ODN处理JAR细胞: JAR细胞悬于含lO小牛血清RIMP1640液 中,以1×10;个/ml,2201/孔接种于96孔板, 每组重复5孔,37?过夜.实验分组(1)AS一 0DN组:加AS一0DN,又分为5,umol/L, l0t~mol/L,20~mol/L组,每组重复5孔,过夜 24h后加药(溶于培养液).先取上清l10V-I,分 终浓度5v.mol/L,10~mol/L,20v-mol/L,加药 作用72h取上清待测;(2)对照组:方法同AS— ODN组,加药改为加同体积的培养液;(3)正义 组:方法同AS—ODN组;(4)随机组:方法同 AS—ODN组. 1.2.3形态学观察:各作用时间点用倒置相差 显微镜(Nikon公司产品)观察和拍摄各浓度用 药组,对照组的照片,记录细胞形态学改变. 1.2.4hCG—B测定:在各作用时间,浓度点吸 取上清置于一2O?保存,一次性用hCG—B放免 试剂盒测定hCG.测定前,上清液37?溶解, 3000r/min,5rain离心,去除细胞碎片,测定 按试剂盒说明书操作. 12.5统计学处理正义组,反义组,随机组均 与空白对照组进行比较,采用秩和检验 2结果 2.1AS—ODN不同时间处理JAR细胞与 对照组相比,AS—ODN作用JAR细胞24h后, hCG分泌开始下降(44.5,P<0.01),作用 JAR细胞48h后,hCG分泌下降最显着 (47.8,尸<0.01),作用JAR细胞72h后, hCG分泌下降39.8.48h后(补足用药24h 后),下降最显着(57.5,尸<0.01),72h和 96h后(补足用药48h和72h后),分别下降 20.2(_P<0.01)和36.2(尸<0.01);72h 和96h后(补足用药24h和48h后),分别下 降40.6(尸<0.01)和27.5(尸<0.01);96 h后(补足用药24h后),下降最显着为55.1 (尸<O.01)L表1). 2.2不同浓度AS—ODN对JAR细胞hCG分 泌的影响与对照组相比,AS一0DN5/amol/ L,10,umol/L,20tLmol/L作用JAR细胞72h 后hCG分泌下降分别为55,5(尸<O.01), 71.6(尸<0.01),92.1(尸<0.01)(表2). 第5期陈援越,荨.hCG一3反义寡瞪氯棱苷酸对凡缄癌JAR细胞hCG丹*作用的 研究?205 表1AS一0DN作用不同时间对JAR细胞 hCG分泌的影响(?,一3) 组别— hCG — (rig/mr) 24h48h72h 对照组 正义组 反义组 髓机组 3934士067 40.56士092 2l76士007' 46.13士172 47.08士l_73 52.93士1415 '60士0.46' 5184士4.89 51.15士400 5465士511 34?士O.07 4807士1l1 表2不同浓度AS—ODN对JAR细胞 hCG分泌的影响(?s,=5) 组别————竺!一 51020 对照组 正义组 反义组 随机组 19448士315212.60士16.4531360士1321 18514士0.1922942士2.9619765士5.25 87.44士241'60,25士3.40'2478士4.1】' 19956士352229.09士139413555士6.79' <001 2.3AS—ODN对JAR细胞生长情况的影响 与对照组相比,AS.ODN作用72h后,随着 浓度升高和时间延长,细胞间隙变宽,细胞贴壁 程度下降,表明随AS-ODN浓度增加,细胞生 长活力呈下降趋势(图1,2). 3讨论 应用反义技术阻断特异性的蛋白合成,近 年来受到广泛重视.文献报道口]AS—ODN的浓 度一般在O,50~mol/L.为了证明反义核酸的 特异作用,本研究中设计正义核酸与随机核酸, 同样条件作用于培养中JAR细胞.结果显示正 义组与随机组对hcG分泌的抑制作用均不如 反义核酸组.提示本研究中反义核酸组对JAR 细胞hCG分泌的抑制作用并非由于寡核苷酸 的非特异作用所致.本研究发现,5.umol/L的 hCG.BAS—ODN作用于JAR细胞,hCG分泌 明显受抑制并且5,10,20~mol/L不同浓度 AS—ODN作用72h时,抑制率分别为55.5 (P<0.01),71.6(P<0.01),92.1(P< 0.01),提示在20~mol/L浓度内,AS—ODN的 剂量增加,对hCG分泌的抑制作用也随着增 加,是否存在着剂量一效应关系则需进一步的 研究.但从20~mol/L的孓ODN,R—ODN也对 图ZAS—ODN(10~mol/L)怍用JAR细掘72h,200~ hcG的分泌有一定的抑制作用看,说明更大剂 量的AS—OD的非特异性细胞毒性也会显着增 加,而5,10.umol/L浓度的S—ODN和R—ODN 则无明显抑制作用本研究中,即使在20 ~mol/L量的条件下,仍不能完全阻断hCG的 分泌,是否可能与这类细胞hcG分泌旺盛有 关,非大量的hCG—BAS—ODN不足以完全阻断 hCG的分泌,需要探讨5,10.umol/L的hCG— BAS—ODN使培养中的hCG分泌细胞hCG分 泌显着减少,而该浓度的s—ODN和R—ODN无 明显抑制作用,提示5,10~mol/L浓度hCG—p AS—ODN有希望作为hcG分泌抑制物应用. 除了浓度因素外,AS—ODN的作用时间对 hCG的分泌也产生一定的影响.从本研究结果 看:用10~mol/L浓度的AS—ODN处理JAR 细胞24h,hcG分泌抑制作用即开始出现,抑 制率为44.5(P<0.01),作用48h抑制率最 显着为47.8(P<O.01),但72h抑制作用有 新江大学(医学版)第29眷 所减弱,抑制率为39.8,即使在连续给予 hCG—BAS—ODN补充的条件下.因此,在选定 合适的反义hCG序列后,如何进行修饰,以维 持较长时间的作用,成了该技术成功与否重要 的一环.已合成的hCG蛋白半衰期为24h【'], 72h以后出现回升的可能原因有:(1)培养中 处于不同时期(G.,Gt,S/G:,M)的细胞.对 AS—ODN的摄入是不均一的,部分JAR细胞 未受AS.ODN的作用而继续分泌hCG;(2)随 着与AS—ODN培养时间的延长,细胞中AS— ODN的酶功能增强,即使在取上清后已补足 AS一0DN,仍不足以阻断hCG蛋白的合成;(3) 本研究序列和修饰需进一步优化]. ChaoLiu口报道0,50/~mol/LODN未发 现毒性作用.本研究显示.2O/~mol/L浓度 ODN,其s—ODN和RODN对hCG的分泌均 呈现一定的抑制作用,这可能是其对JAR细胞 的毒性所致.可能的原因(1)ODN对mRNA非 特异性阻断;(2)或mRNA与ODN杂交后降 解产物的潜在毒性及其生物学效应的共同结 果.提示不宜采用2Opmol/L以上的AS—ODN 作特异性调控应用. R[vera[日报道hCG—a反义技术致肺癌 ChaGo细胞形态学发生改变.从本研究结果 看,当JAR细胞在受到AS—ODN作用后一定 时间,细胞出现生长缓慢,间隙扩大等.是AS— ODN对细胞的直接作用所致,还是这类细胞生 长对hCG有一定的依赖性,即存在自分泌现 象,正在进一步研究. 参考文献 [1]SommerW,Hei]]igMAntisense.【?c【eotid?re clinicallytestedTheyinhibittheexpressionofdisease relatedge.e~D]Lakaridningen.1999Jan27~96(4): 348—354 [93YukihiroAkaoHizoguehiKonradMisiuraetalAnti— senseo]igodeoxyrigonuc[eotideagainsttheMML—LTG 19chimerictranscriptinhibitseel【growthandinduces apoptosisinceLLofinfamiLeLeukemiacellLinecarrying thet(11;19)chromoso~[cransLocation[1].CancerRe— 3776 search-1998,Sepzembe,1t98:3773— [3]ChaoLiufmranAhmadxu"Jie.eta__Modulationof muLtidrugresistancegene(md1)w】thantisease .I'go?I?t1des玎Cli.italsce,1996,91(2) 93—98. 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