DNA甲基化检测方法

DNA 甲基化检测 范保星 综述　张开泰　吴德昌 审校 (军事医学科学院放射医学研究所, 北京 100850) 　　摘要: DNA 甲基化是真核细胞基因组重要修饰方式之一, 参与基因的表达调控。目前,DNA 甲基化检测的方法主要有: 酶切、限制性酶切2PCR (restrict ion enzym e PCR )、甲基化特异性 PCR (m ethylat ion2specific PCR ,M S PCR )、Sou thern 印迹亚 硫酸盐测序 (b isu lfite DNA sequencing)、变性高效液相色谱 (denatu re h igh2perfo rm ance liqu id ch rom atography, DH PL C)、甲 基化敏感的单核苷酸引物延伸 (m ethylat ion2sensit ive single nucleo tide p rim er ex tensio,M S2SN uPE)、PCR 荧光变性曲线 ( PCR and fluo rescence m elt ing cu rve analysis)、亚硫酸盐 PCR 2SSCP (b isu lfite2PCR 2SSCP)、COBRA (com bined b isu lfite re2 strict ion analysis)和M ethyL igh t。 关键词: DNA 甲基化; DNA 甲基化检测方法; PCR 中图分类号: Q 753　文献标识码: A 　文章编号: 100121048 (2002) 0220099203 收稿日期: 2001206219 作者简介: 范保星 (19732) , 男, 在读博士研究生 资金项目: 国家重点基础研究发展规划 973 项目 (G1998051208) 　　基因表达的甲基化调节已经成为分子生物学 研究的热点之一。基因启动子及其附近区域内CpG 甲基化是众多基因实现去表达 (沉默) 和基因印记 的重要途径, 通过测定启动子CpG 岛甲基化状态了 解基因是否去表达, 为研究基因表达提供了在 DNA 水平进行的重要途径。本文就CpG 位点甲基 化的测定主要方法进行了论述。 1　酶切法 该法是检测基因组DNA 甲基化水平的一种常 用方法[ 1 ]。提取基因组DNA , 采用对 52甲基胞嘧啶 敏感的限制性核酸内切酶作用于基因组DNA。对 于不存在甲基化的DNA 标本, 核酸内切酶会在识 别序列处切断DNA 双链; 对于存在甲基化的DNA 标本, 则不能切断DNA , 然后以琼脂糖凝胶电泳检 测酶切结果。不同的核酸内切酶识别序列不一样, 根据实验目的来选择不同的核酸内切酶。简捷的酶 切法不仅可以反映出DNA 甲基化水平是否改变, 而且还能通过酶的识别位点反映出甲基化的部位。 不足之处在于能用的限制性内切酶很少, 无法分析 非酶切位点上的胞嘧啶甲基化, 从而不能反映整个 CpG 岛的甲基化状态。 2　限制酶 PCR (rcst rict ion enzym e PCR ) 基因组DNA 分别经甲基化敏感和非敏感的核 酸内切酶酶切后为, 用待检甲基化位点外侧序 列为引物进行扩增。甲基化敏感的内切酶酶切后的 DNA 若存在甲基化, 则会扩增出包含有甲基化 CpG 位点的片段; 若不存在甲基化则不会有任何片 段扩出。当用甲基化非敏感的内切酶酶切后的 DNA 为模板时, 不论该部位是否甲基化都不应有 片段扩出。该方法的主要不足为: ①DNA 必须酶切 完全, ②如果待检片段中有多处 CpG 位点, 并且有 些 CpG 位点是甲基化的, 而有些 CpG 位点是非甲 基化的, 那么对结果将难以得出结论[ 2 ]。 3　甲基化特异性 PCR (m ethyla t ion2specif ic PCR , M S PCR ) 　　该法是检测基因组DNA 甲基化水平的一种常 用方法, 原理是DNA 经亚硫酸氢钠处理后, 非甲基 化的胞嘧啶转变为尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持 不变。在 PCR 反应时, 有两套不同的引物对: 其一 引物序列来自经处理后的甲基化DNA 链, 若用该 对引物能扩增出片段, 该检测位点发生了甲基 化; 另一引物来自经处理后的非甲基化DNA 链, 若 用该对引物能扩增出片段, 说明该检测位点没有甲 基化。两对引物都具有很高的特异性, 与未经处理 的DNA 序列无互补配对[ 3 ]。M S PCR 是一种快速 检测方法, 只需极少量的DNA 用于分析。不足之处 在于: ①引物的选择和非常关键, 否则易导致 假阳性; ②如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全, 也 易导致假阳性; ③M SP 法是以引物中所有 CpG 位 点胞嘧啶均完全甲基化为前提设计的, 而事实上甲 基化的CpG 岛中却并非每个CpG 位点都完全甲基 化, 所以,M SP 法常常存在目标片段难扩增, 或者特 异性差等问题, 不能反映整个CpG 岛甲基化状态的 缺陷[ 4 ]。 ·99·国外医学遗传学分册　2002 年　第 25 卷　第 2 期 4　Sou thern 印迹 Sou therm 印迹是分析DNA 甲基化常用的方 法[ 5 ] , 用甲基化敏感和非敏感的核酸内切酶对DNA 进行酶切, 对不同位点CpG 甲基化的分析需选择针 对该位点特异的核酸内切酶, 酶切后的片段经电泳 分离后转移至尼龙膜上, 然后用与目的片段特异的 探针进行杂交, 经显影后既可分析待检片段的甲基 化状态。该方法的不足为: ①需要较大量的基因组 DNA ; ②如果酶切不彻底会干扰杂交结果。 5　亚硫酸盐测序 (b isu lf ite DNA sequencing) 该技术是检测基因组DNA 上胞嘧啶单核苷酸 甲基化的较好方法[ 6 ] , 原理是DNA 经亚硫酸氢钠 处理后, 非甲基化序列的胞嘧啶会变成尿嘧啶, 而 甲基化的胞嘧啶保持不变, 随后用高度特异性的引 物进行扩增, 模板上的尿嘧啶将会被扩增为胸腺嘧 啶, 然后对扩增片段进行测序。利用该方法时要注 意DNA 应被亚硫酸氢钠充分处理, 有报道称靠近 甲基化 CpG 位点的非甲基化胞嘧啶具有对亚硫酸 氢钠的抵制作用。 6　变性高效液相色谱 (dena tu re h igh2perfo rm ance liqu id ch rom atography,DH PL C) 　　DH PL C 与 PCR 联用, 能够简易、快速检测 DNA 胞嘧啶的甲基化[ 7 ]。原理是DH PL C 能够快速 区分变性温度不同的DNA 片段, 用亚硫酸氢钠处 理 DNA , 再用特异性聚合酶链反应 (PCR ) 对待检 基因启动子含 CpG 位点的靶序列进行扩增; 利用 DH PL C 在部分变性温度下测定靶序列的保留时 间, 发生甲基化基因 PCR 产物的保留时间明显延 长, 从而可以判断出甲基化的基因。DH PL C 特别适 合分析细胞构成混杂、同时存在甲基化和非甲基化 模板的组织样品, 同时还可获得基因一级结构变异 的信息。DH PL C 测定法虽然能够测定整个扩增区 域内 CpG 位点的甲基化, 但是不能对甲基化 CpG 位点进行精确定位。在目的基因去表达时, 如果靶 CpG 位点不是完全甲基化,M SP 法和酶切法的非 甲基化测定结果可能毫无意义, 而DH PL C 法由于 能够显示整个目标片段中的所有 CpG 位点的总甲 基化状态, 测定结果更可靠。 7　甲基化敏感的单核苷酸引物延伸 (m ethyla t ion2 sen sit ive sing le nucleo t ide p rim er ex ten sion, M S2 SN uPE) 　　该方法的原理是[ 8 ]: DNA 经亚硫酸氢钠处理后 为模板, 用特殊设计的引物对目的片段扩增, 扩增 反应会在待检甲基化位点的前一个核苷酸处终止, 扩增后的DNA 经纯化后分别与放射标记的 dCT P 或 dT T P 在DNA 聚合酶作用下共孵育, 如果待检 位点是甲基化的, dCT P 将会在延伸反应中掺入, 反 之 dT T P 会掺入。对 dCT P 和 dT T P 的掺入的量进 行测定后, 即可分析出该位点的甲基化状况。引物 设计和DNA 的完全处理是该方法的关键。 8　PCR 荧光变性曲线分析 (PCR and fluo rescence m elt ing cu rve ana lysis) 　　该方法不但简单、费用低, 而且还可检测目的 序列上多个CpG 位点的甲基化, 所用仪器为带有荧 光检测器的 PCR 仪。DNA 经亚硫酸盐处理后, 对 待检DNA 片段进行 PCR 扩增, 退火时温度进行线 性变化。通过检测器检测双链DNA 结合染料的荧 光强度 (SYBR Green I) , 即可获得待检DNA 的变 性温度曲线。通过变性温度的不同即可区分甲基化 与非甲基化的DNA [ 9 ]。 9　亚硫酸盐 PCR 2SSCP (b isu lf ite2PCR 2SSCP) DNA 经亚硫酸盐处理后, 对待检DNA 片段进 行 PCR 2SSCP 扩增, 然后进行电泳分析[ 10 ]。 10　COBRA (com b ined b isu lf ite rest rict ion analy2 sis) 　　COBRA 能定量检测微量DNA 样品特定基因 位点的甲基化状态。DNA 经亚硫酸氢钠处理后, 对 待检测部位进行 PCR 扩增, 再选用可切开待检测 位点的酶对 PCR 产物进行切割, 然后电泳分析, 根 据电泳条带的不同及亮度即可检测出DNA 的甲基 化状态及甲基化程度[ 11 ]。 11　M ethyL igh t M ethyL igh t 可高敏感和高温量的对微量DNA 样品的甲基化进行定量检测。DNA 经亚硫酸氢钠 处理后, 用荧光定量 PCR 进行扩增。引物选用位点 特异的引物, 同时在两对引物之间设计一个可与待 检测位点互补的探针, 探针的两端用荧光标记, 5′为 报告荧光 (6FAM ) , 3′为淬灭荧光 (TAM RA ) , 如果 探针可与待检位点杂交, 那么在 PCR 延伸时, T aq DNA 聚合酶 5′到 3′端的核酸酶活性会将探针序列 5′端的报告荧光基团切下, 通过检测该报告基团荧 光信号的强弱即可判断出DNA 的甲基化状态。另 外也可对引物进行荧光标记, 并通过引物与探针的 ·001· 国外医学遗传学分册　2002 年　第 25 卷　第 2 期 不同标记组合, 检测多个位点的甲基化水平[ 12 ]。 本文就目前检测DNA 甲基化的主要方法进行 了论述, 其中酶切、M S PCR 和 Sou thern 印迹是目 前进行DNA 甲基化检测的常用方法。但任何实验 方法都有其不足, 在应用时要根据实验目和待检测 位点的序列特征选择合适的方法。相信, 随着科学 技术的不断发展和完善, 新的检测方法将不断出 现。 参考文献 [ 1 ]　卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 北京: 高等教育出版 社, 1993, 4652497. [ 2 ]　Kane M F et a l . Cancer Res, 1997, 57: 8082811.[ 3 ]　H ennan JG et a l . P roc N atl A cad Sci U SA , 1996, 93: 982129826.[ 4 ]　D eng G et a l . Cancer Res, 1999, 59: 202922033.[ 5 ]　苏长青等. 中华医学遗传学杂志, 2000, 17: 36238.[ 6 ]　Grigg G et a l . B ioessays, 1994, 6: 4312439.[ 7 ]　邓大君等. 中华医学杂志. 2001, 81: 1582161.[ 8 ]　Gonzalgo M et a l . N ucleic A cids Res, 1997, 25: 252922531.[ 9 ]　W o rm J et a l . C lin Chem , 2001, 47 (7) : 118321189.[ 10 ]　M aekaw a M et a l , C lin Chem L ab M ed, 2001, 39 (2) : 1212128.[ 11 ]　X iong Z et a l . N ucleic A cids Res, 1997, 25 (12) : 253222534.[ 12 ]　Eads CA et a l . N ucleic A cids Res. 2000, 28 (8) : E32. 胶质瘤联合基因治疗策略研究新进展 龙　江1综述　朱贤立2审校 　　　　　　　　 (1. 昆明医学院第一附属医院神经外科, 云南 昆明 650031; 2. 华中科技大学同济医学院附属协和医院脑外科, 湖北 武汉 430022) 　　摘要: 胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤, 传统治疗方法包括手术切除、放疗和化疗的效果及潜力有限, 病人预后极差。随着对 胶质瘤发病机制的深入研究, 新的治疗方式基因治疗已广泛用于胶质瘤治疗的试验和临床研究。本文就近年国内外对胶质瘤 基因治疗研究的几个方面作一简要综述。 关键词: 胶质瘤; 基因治疗 中图分类号: R 739. 41　文献标识码: A 　文章编号: 100121048 (2002) 0220101204 收稿日期: 2001204212 作者简介: 龙江 (19692) , 男, 在读博士研究生 　　胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤, 传统治疗方法包 括手术切除、放射治疗和化学疗法的效果及潜力都 极为有限, 病人预后极差。随着肿瘤分子生物学、分 子遗传学的研究进展, 对胶质瘤发病机制认识的深 入, 以及DNA 重组和基因转染技术的发展, 使胶质 瘤基因治疗成为可能。1992 年美国N IH 首先应用 逆转录病毒介导的H SV 2tköGCV 系统对人类胶质 瘤的体内基因治疗[ 1 ] , 从此全世界掀起了胶质瘤基 因治疗研究的热潮。现就此综述如下: 1　基因治疗慨述 肿瘤基因治疗是针对肿瘤发生的遗传学背景, 引入外源性目的基因到肿瘤细胞或其他细胞内, 以 纠正或补偿缺陷基因从而达到治疗肿瘤的目的。基 因治疗按策略可分为两种途径: 第一种是以破坏肿 瘤细胞为目的的基因治疗, 包括: ①自杀基因治疗; ②免疫基因治疗; ③溶瘤病毒治疗; 另外一种基因 治疗是以纠正肿瘤细胞的生物学性状为目的, 包括 转染抑癌基因和肿瘤反义基因治疗。基因治疗的方 式有两种: ①是体内直接转基因, 这是最有前途的 方式, 也是各种基因转移技术集中攻关的方向, 但 目前仍存在基因转移和表达效率低的问题; ②是细 胞介导的基因治疗, 这是目前常用的方式, 即选择 适当的细胞, 在体外进行基因转移, 筛选出表达外 源基因的细胞, 再将这些细胞移植于体内。常用外 源基因转移的方法主要有生物学方法和非生物学 方法, 前者主要是利用载有外源基因的缺陷病毒感 染受体细胞, 如常用的逆转录病毒载体单纯疱疹病 毒载体 (H SV )、腺病毒载体 (A d)等。后者是利用物 理或化学的方法, 如显微注射、电穿孔、基因枪及脂 质体包裹等技术[ 2, 3 ]。恶性胶质瘤由于完全局限在 中枢神经系统, 几乎不发生远处转移, 因此是局部 基因治疗的首选疾病。由于血脑屏障的存在, 常用 立体定向技术或直接注入的方式将治疗基因植入 瘤腔[ 4 ]。 ·101·国外医学遗传学分册　2002 年　第 25 卷　第 2 期