蛹虫草液体菌种培养和使用研究

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 蛹虫草液体菌种培养和使用研究 朱寿荣 , 温 鲁 3 , 吴梅艳 , 姜春歌　(淮阴师范学院资源微生物研究所 ,江苏淮安 223300) 摘要　[目的]明确碳氮源和培养对蛹虫草液体菌种的影响。[方法]配制不同碳氮源的培养液 ,接种蛹虫草菌种后分别进行振荡培 养和静置培养 ,观察培养液中菌丝球的大小、多少和分生孢子数量 ,再进行栽培比较。[结果]碳源以玉米糁、玉米、小麦、小麦米为好 ,氮 源以蛹汤和蛋白胨为好 ,培养方法则以振荡培养为好。[结论]选用适宜碳氮源进行蛹虫草的振荡培养 ,可获得优良的液体菌种。 关键词　蛹虫草 ;液体菌种 ;振荡培养 ;静置培养 ;菌丝球 ;分生孢子 ;代料栽培 中图分类号　Q936 　　文献标识码　A 　　文章编号　0517 - 6611(2007) 36 - 11908 - 02 Research Cultivation and Use of the Bacterium Growth Liquid of Cordyceps militaris ZHU Shou2rong et al 　(Resource and Microorganism Research Institute ,Huaiyin Teachers College ,Huaian ,Jiangsu 223300) Abstract 　In order to clarify the effect of carbon and nitrogen source and cultivation method on the bacterium grows liquid of Cordyceps militaris sinensis , several culture solutions were prepared with the different carbon and nitrogen sources ,and inoculated with the bacterium grows liquid of Cordyceps militaris sinensis. Then it was cultivated by oscillating and quiet ways separately. The size ,number of hypha ball and the amount of mitogenic spore in culture solu2 tion were observed and the cultivated methods were also compared. The result indicated the better carbon source were maize ,rice ,and wheat grain ;the bet2 ter nitrogen source were pupa soup and peptone ;and oscillating cultivation was better than quiet cultivation. The conclusion was the excellent bacterium liq2 uid of Cordyceps militaris sinensis can be obtained with the proper carbon and nitrogen source and oscillating cultivation method. Key words 　Cordyceps militaris ;Bacterium growth liquid ;Oscillating cultivation ;Quiet cultivation ;Hypha ball ;Mitogenic spore 作者简介 　朱寿荣 (1984 - ) ,女 ,江苏灌南人 ,本科生 ,专业 :生物科 学。3 通讯作者。 收稿日期　2007208215 　　蛹虫草[ Cordyceps militaris (L. )Link] ,别名北冬虫夏草、北 虫草 ,属麦角菌科 (Clavicipitaceae) 虫草属 ( Cordyceps) ,蛹虫草 是该属的模式种[1] 。已有许多研究认为蛹虫草可作为冬虫 夏草的替代品 ,其虫草素含量为冬虫夏草的数十倍[2] 。虫草 素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤 ,以及抗疲劳、抗衰老、提高人体 免疫力等显著功效[3] ,而蛹虫草是获得虫草素的主要来源。 经过多年研究 ,蛹虫草已可进行规模化人工培养。在蛹 虫草的研究和培养过程中 ,液体菌种的应用越来越普 遍[4 - 5] 。不同碳氮源培养的蛹虫草液体菌种 ,在性状上有何 差异 ,使用效果如何 ,尚未见报道。笔者对此进行了研究 ,现 将研究情况报道如下 : 1 　与方法 1. 1 　材料 1. 1. 1 　菌种。蛹虫草 3 # 和 6 # 菌株 ,由淮阴师范学院资源微 生物研究所提供 ,将母种扩接到小麦培养基中培养而得。 1. 1. 2 　碳氮源和试剂。碳源有马铃薯、玉米、玉米糁、小麦、 小麦米、杂交米、白糖和红糖 ,氮源有蛋白胨和蚕蛹 ,矿质元 素添加剂有磷酸二氢钾、硫酸镁和石膏 ,其中磷酸二氢钾、硫 酸镁为纯试剂 ,蛋白胨为生化试剂 ,其余材料购自市场。 1. 1. 3 　设备。XSX2HX7 型相衬显微镜 (重庆光电仪器总公 司) ,XB2K225 血细胞计数板 (上海医用光学仪器厂) ;高压灭 菌锅、洁净工作台、振荡培养箱、恒温培养箱、光照培养箱等 , 均为实验室常规设备。 1. 2 　方法 1. 2. 1 　液体培养基制作。①马铃薯蛋白胨培养液 :马铃薯 200. 00 g ,加 1 000 ml 自来水 ,煮沸 10 min ,用纱布过滤 ,滤液 加白糖 20. 00 g ,磷酸二氢钾 1. 00 g ,硫酸镁 0. 50 g ,石膏 1. 00 g ,蛋白胨 10. 00 g ,补水至 1 000 ml ,搅拌溶解 ,分装 10 个 300 ml 三角瓶 ,每瓶 100 ml。②马铃薯蛹汤培养液 :马铃薯200. 00 g ,加 750 ml 自来水 ,煮沸 10 min ,用纱布过滤 ,滤液加白糖 20. 00 g ,磷酸二氢钾 1. 00 g ,硫酸镁 0. 50 g ,石膏 1. 00 g ,补水 至 750 ml ,搅拌溶解 ,再加 250 ml 蛹汤 (熬制方法见后) ,分装 10 个 300 ml 三角瓶 ,每瓶 100 ml。③玉米蛋白胨培养液 :玉 米 100. 00 g ,加 500 ml 自来水 ,小火煮沸 1 h ,滤去玉米粒 ,滤 液加白糖 10. 00 g ,磷酸二氢钾 0. 50 g ,硫酸镁 0. 25 g ,石膏 0. 50 g ,蛋白胨 5. 00 g ,补水至 500 ml ,搅拌溶解 ,分装 5 个三 角瓶 ,每瓶 100 ml。④玉米蛹汤培养液 :玉米 100. 00 g ,加 500 ml 自来水 ,小火煮沸 1 h ,滤去玉米粒 ,滤液加白糖 10. 00 g ,磷 酸二氢钾 0. 50 g ,硫酸镁 0. 25 g ,石膏 0. 50 g ,补水至 375 ml , 搅拌溶解 ,再加入 125 ml 蛹汤 ,分装 5 个 300 ml 三角瓶 ,每瓶 100 ml。⑤小麦蛋白胨培养液 :小麦 100. 00 g ,煮沸 30 min ,其 余同③。⑥小麦蛹汤培养液 :小麦 100. 00 g ,煮沸 30 min ,其 余同④。⑦小麦米蛋白胨培养液 :小麦米 25. 00 g ,煮沸 15 min ,其余同③。⑧小麦米蛹汤培养液 :小麦米 25. 00 g ,煮沸 15 min ,其余同④。⑨杂交米蛋白胨培养液 :杂交米 25. 00 g , 煮沸 15 min ,其余同③。⑩杂交米蛹汤培养液 :杂交米 25. 00 g ,煮沸 15 min ,其余同 ④。瑏瑡玉米糁蛋白胨培养液 :玉米糁 25. 00 g ,煮沸 15 min ,其余同③。瑏瑢玉米糁蛹汤培养液 :玉米 糁 25. 00 g ,煮沸 15 min ,其余同④。 蛹汤熬制方法 :称取 40. 00 g 干蚕蛹 ,加 1 000 ml 自来水 , 煮沸 30 min ,滤去蛹渣 ,将滤液补水至 1 000 ml 备用。以上培 养液装瓶后 ,均用 115 ℃灭菌 30 min。 1. 2. 2 　栽培培养基制作。以罐头瓶为栽培容器 ,每瓶加杂 交米 30. 00 g ,石膏 0. 30 g ,营养液 40 ml (营养液 :红糖 2. 0 % ,磷酸二氢钾 1. 0 ‰,硫酸镁 0. 5 ‰,其余为自来水) ,用 聚丙烯薄膜封口后 ,125 ℃灭菌 1 h。 1. 2. 3 　接种与培养。①和 ②号配方各接 5 瓶 3 # 和 5 瓶 6 # 菌种 ,其余配方全部接 3 # 菌种 ,每瓶接入 6 颗菌种麦粒。将 ①3 # 和①6 # 、②3 # 和 ②6 # ,以及其余配方各取 2 瓶 ,振摇后 放入恒温培养箱 ,于 25 ℃静置培养 ;剩余三角瓶放入振荡培 养箱 ,25 ℃静置 1 d 后 ,用 150 r/ min 振荡培养。 1. 2. 4 　菌丝球大小及数量观测。振荡培养的培养液 ,24 h 后 开始产生菌丝球 ,48 h 后每天观测菌丝球大小及数量。 安徽农业科学 ,Journal of Anhui Agri. Sci. 2007 ,35 (36) :11908 - 11909 　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　李洪 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 1. 2. 5 　分生孢子检测。培养到第 4 和第 5 天 ,对振荡和静置 培养液中的分生孢子 ,用相衬显微镜和血细胞计数板计数。 1. 2. 6 　栽培试验。培养 5 d 后 ,取出振荡培养和静置培养的 液体菌种 ,分别接种到栽培瓶中 ,振荡菌种每瓶接种 1 ml ,静 置菌种每瓶接种 2 ml ,于 25 ℃遮光培养。菌丝满瓶后降温 (20 ℃) 、见光 ,并用大缝纫针在封口薄膜上扎孔 ,每瓶 10 孔 , 同时喷水增加空气湿度。 2 　结果与分析 2. 1 　菌丝球大小及数量 2. 1. 1 　结果。振荡培养 4 d 的液体菌种 ,观测结果见表 1。 菌丝球大小随振荡培养时间的延长而增大 ,菌丝球数量随振 荡培养时间的延长而增多。其他时间不同培养液中菌丝球 的相互比较情况 ,与第 4 天类似。静置培养的液体菌种 ,几 乎看不到明显变化。 　　表 1 不同培养液中菌丝球大小及数量 培养液 菌株 菌丝球大小∥mm 菌丝球数量 ① 3 # 2. 0～3. 0 少 ① 6 # 2. 0～3. 0 少 ② 3 # 3. 0～4. 0 较少 ② 6 # 2. 0～3. 0 少 ③ 3 # 1. 0 较多 ④ 3 # 1. 0～2. 0 多 ⑤ 3 # 1. 0～1. 5 较少 ⑥ 3 # 1. 0～2. 0 多 ⑦ 3 # 1. 0～2. 0 多 ⑧ 3 # 3. 0～4. 0 较多 ⑨ 3 # 0. 5～1. 0 较多 ⑩ 3 # 1. 0～2. 0 较多瑏瑡 3 # 0. 5～1. 0 很多瑏瑢 3 # 1. 0 很多 2. 1. 2 　分析。从表 1 可见 ,在碳源中 ,以玉米糁为碳源的 瑏瑡、瑏瑢菌种 ,菌丝球体积小而数量多 ,作为液体菌种 ,使用后可以 产生大量发菌点 ,这是衡量液体菌种优良性状的重要标志之 一 ;以马铃薯为碳源的①、②液体菌种恰好相反 ,菌丝球体积 大而数量少 ,因此不宜用作液体菌种的培养基 ,如果使用 ,最 好增加无菌研磨工序 ,将较大的菌丝球研磨成较小的菌丝碎 片。氮源中 ,在碳源相同的条件下 ,以蛋白胨为氮源的液体 菌种 ,菌丝球较以蛹汤为氮源的要小一些 ,而两者在菌丝球 数量上差别不大 ,因此均可用作液体菌种的氮源。3 # 和 6 # 菌株的菌丝球大小和数量 ,没有明显差异。 2. 2 　分生孢子数量培养 　振荡培养和静置培养 5 d 的观测 结果见表 2。从表 2 可见 ,振荡培养的分生孢子数量较静置 培养的要多 ,但悬殊不大 ;培养 5 d 比培养 4 d 的分生孢子数 量有明显增加 ,但增加幅度不一。在各种配方的液体菌种 中 ,以④号培养液振荡培养的液体菌种分生孢子最多 ,其次 为⑧和②号振荡培养的液体菌种。不同菌株之间 ,分生孢子 数量没有显著差异。 2. 3 　液体菌种栽培情况　3 # 菌株振荡培养的液体菌种栽培 情况见表 3。3 # 菌株静置培养的液体菌种 ,萌发、生长、满 瓶、出草、产量等情况 ,均比振荡培养的液体菌种差得多。而 6 # 菌株振荡培养的液体菌种 ,栽培效果也比 3 # 菌株差。 从表 3 可见 , 瑏瑡号液体菌种在栽培瓶中萌发较快 ,菌丝 长势最好 ,封面、满瓶、扭结等所需时间最短 ,其次为⑤号 ;而 单瓶产量则以⑤号最高 ,其次为⑦号 , 瑏瑡号排列第 3。 　　表 2 不同培养液中分生孢子数量 ×102 个/ ml 培养液 菌株 振荡(4 d) 静置(4 d) 振荡(5 d) 静置(5 d) ① 3 # 　　5. 2 　　1. 6 　　6. 6 2. 1 ① 6 # 5. 0 1. 5 6. 2 1. 9 ② 3 # 5. 9 2. 3 10. 4 3. 7 ② 6 # 5. 8 2. 2 10. 5 3. 7 ③ 3 # 4. 1 2. 0 9. 6 2. 4 ④ 3 # 11. 8 6. 2 20. 3 7. 9 ⑤ 3 # 5. 9 2. 4 7. 5 2. 8 ⑥ 3 # 5. 6 3. 1 7. 9 4. 7 ⑦ 3 # 6. 5 2. 3 8. 1 3. 0 ⑧ 3 # 6. 4 3. 5 12. 9 6. 5 ⑨ 3 # 6. 7 3. 5 9. 1 4. 8 ⑩ 3 # 8. 3 2. 8 6. 0 3. 1瑏瑡 3 # 6. 0 3. 3 6. 2 4. 8瑏瑢 3 # 7. 3 2. 7 8. 4 6. 6 　　表 3 液体菌种栽培情况 液体 菌株 萌发时间 d 菌丝 长势 封面时间 d 满瓶时间 d 扭结时间 d 子实体干重 g/ 瓶 ① 1. 0 不旺 　22. 0 29. 0 23. 0 16. 20 ② 1. 0 不旺 22. 5 30. 0 24. 0 15. 90 ③ 1. 0 旺 8. 0 28. 0 24. 0 15. 00 ④ 1. 5 旺 8. 5 30. 0 24. 0 14. 70 ⑤ 1. 0 较旺 9. 5 18. 0 24. 0 19. 30 ⑥ 1. 5 较旺 9. 5 17. 5 25. 0 13. 50 ⑦ 1. 0 不旺 18. 0 26. 0 23. 0 18. 50 ⑧ 2. 0 不旺 24. 0 27. 0 23. 0 16. 05 ⑨ 1. 0 旺 10. 0 20. 0 25. 0 16. 40 ⑩ 3. 0 很弱 20. 5 32. 0 26. 0 15. 50瑏瑡 1. 0 很旺 8. 0 17. 0 23. 0 17. 50瑏瑢 1. 5 旺 8. 5 23. 0 23. 5 17. 40 3 　结论与讨论 (1)蛹虫草液体菌种的碳氮源对菌种培养、菌种性状和 使用效果有显著影响。综合培养和性状两个方面 ,碳源以玉 米糁最好 ,玉米也很好 ,小麦次之 ;氮源中蛹汤和蛋白胨都很 好 ,相比之下蛹汤稍优。从栽培结果看 ,碳源以小麦最好 ,小 麦米和玉米糁则各有千秋 ;氮源则以蛋白胨稍优。 (2)振荡培养的液体菌种明显优于静置培养的液体菌 种 ,虽然静置培养的液体菌种也含有大量分生孢子 ,但菌丝 球很少 ,接种栽培的效果很差 ,其中原因还有待研究。 (3)该研究只采用了两株菌株 ,二者在培养液体菌种时 的区别不大 ,但栽培有差别。由于菌株少 ,还不能确定菌株 对液体菌种培养的影响 ,需要结合品比试验再作研究。 参考文献 [1 ] 敬一兵 ,陆鲁生.虫草[M].昆明 :云南科技出版社 ,1986 :20 ,24. [2] 温鲁 ,尹起范 ,唐玉玲 ,等. 蚕虫草与有关虫草活性成分检测比较[J ]. 食品科学 ,2004 ,25(8) :155 - 157. [3] 刘东泽 ,陈伟 ,高新华 ,等. 虫草菌素 (3′2脱氧腺苷)研究进展[J ]. 上海 农业学报 ,2004 ,20(2) :89 - 93. [4] 徐桂香 ,周广麒 ,王世龙.蚕蛹虫草液体培养基的研究[J ].大连轻工业 学院学报 ,1997 ,16(4) :15 - 17. [5] 韦会平 ,肖波.用液体菌种栽培蛹虫草的效果观察[J ].食用菌 ,2004 ,21 (2) :19. 9091135 卷 36 期　　　　　　　　　　　　　　　朱寿荣等　蛹虫草液体菌种培养和使用研究