单增李斯特氏菌检测详解

null进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 SN/T 0184.1-2005进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 SN/T 0184.1-2005李斯特氏菌李斯特氏菌样品的存放与制备样品的存放与制备冷冻样品：应于2℃～5℃解冻，且不超过18小时；若不能及时检验，应置于－15℃保存。 非冷冻的易腐样品：尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。 无菌取样品25g(mL)放入灭菌均质杯或均质袋中加225mL FB1增菌液中，充分均质。增菌培养增菌培养 225mL FB1 30℃±1℃培养25h±1h，吸取1mL，加入10mL FB2增菌液中30℃±1℃二次增菌25h±1h。VIDAS快速筛选（可选）VIDAS快速筛选（可选） FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 筛选为阴性的结果可直接未检出。 筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。分离培养分离培养取增菌液一环，划线分离于选择性培养基OXA、PALCAM上，35℃±1℃培养24h～48h。 菌落形态：24h后菌落呈现黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环。培养48h，菌落仍成黑色，直径2mm～3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。 挑取5个或更多的可疑菌落，接种于TSA-YE。 鉴定鉴定蓝色菌落检验 用45°斜射光照射TSA-YE平板，菌落呈现蓝灰色到蓝色。 （设标准菌株对照）鉴定鉴定典型运动镜检 李斯特氏菌为短棒状杆菌，可见轻微的旋转翻滚。 （设标准菌株对照） 注：压片法或悬滴法 暗光鉴定鉴定革兰氏染色 短杆状革兰氏阳性反应 注：陈旧培养物多转为阴性。鉴定鉴定过氧化氢酶试验 挑取TSA-YE平板上的菌落于洁净载玻片上，滴加1滴3％的过氧化氢溶液，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。鉴定鉴定溶血试验 刺种7％羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h～48h。 单核细胞增生李斯特氏菌 窄小的β溶血环 西尔李斯特氏菌 窄小的β溶血环 绵羊李斯特氏菌 大的β溶血环 其他 不溶血鉴定鉴定动力试验 穿刺SIM半固体培养基，于室温（20℃～25℃）培养48h。 李斯特氏菌有动力，呈典型的伞状生长。鉴定鉴定硝酸盐还原试验 接种于硝酸盐肉汤，于35℃培养5d。 李斯特氏菌为阴性。鉴定鉴定MR－VP试验 接种于MR－VP肉汤中，于35℃培养48h。 李斯特氏菌为阳性反应。鉴定鉴定三糖铁试验 接种于TSI，35℃培养5d。 李斯特氏菌斜面和底层产酸，不产硫化氢。鉴定鉴定尿素酶试验 穿刺尿素琼脂斜面，于35℃培养5d。 李斯特氏菌尿素酶试验阴性。鉴定鉴定糖发酵试验 接种0.5%葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内，35℃培养24h～48h，阴性继续培养到第5天。李斯特氏菌菌种鉴别特征李斯特氏菌菌种鉴别特征鉴定鉴定协同溶血试验（cAMP） 在羊血琼脂平板上各划一直线，使两线平行，在平行线上分别接种金黄色葡萄球菌ATCC49444和马红球菌ATCC6939，在两线之间垂直接种，与两线相近但不相交，于35℃培养24h～48h后，观察相交处溶血情况。L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii窄的β溶血带 不溶血 宽的β溶血带CAMP (Staphylococcus aureus) CAMP (Staphylococcus aureus) Staphylococcus aureusListeria monocytogenes鉴定鉴定API鉴定试验 可代替硝酸盐还原、MR-VP、三糖铁、糖发酵、尿素酶和CAMP等试验。 鉴定鉴定血清学检验 菌悬液于80℃水域中加热1h，离心弃上清，剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。 单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B，1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C，4D，4E，7质量控制质量控制每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。 样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有10个～100个单核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性培养物，按检验程序进行同步检验。报告结果报告结果协同溶血试验、血清学试验可根据需要进行，常规检验可不进行这些试验。 报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌。 报告阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌。 新旧标准的主要不同新旧标准的主要不同增菌培养基 EB Fraser 选择性培养基MMA OXA和PALCAM 生化试验和协同溶血试验 API鉴定 增加VIDAS快速筛选 取消小鼠毒力试验显色培养基显色培养基CHROMagarTM Listeria上单细胞增生李斯特氏菌菌落特征