人参皂甙Rb1对大鼠慢性缺氧性认知功

人参皂甙Rb1对大鼠慢性缺氧性认知功 ·4242· 现代生物医学进展www.shengwuyixue.comProgressinModernBiomedicineVol.13NO.22AUG.2013 人参皂甙Rb1对大鼠慢性缺氧性认知功能障碍的治疗作用* 刘慧琳 刘 涛徐孝娜王冰水 王 枫△ （第四军医大学营养与食品卫生学教研室陕西西安710032） 摘要目的：目前尚无特效的防治慢性缺氧性认知功能障碍措施，前人的研究提示人参皂甙Rb1可能有上述功效，故本实验拟研究人参皂甙Rb1对大鼠慢性缺氧性认知功能障碍的治疗作用及其可能机制。方法：取雄性成年SD大鼠30只，随机分为对照组、d模型组、人参皂甙Rb1（2mg/kg·）治疗组。采用Morris水迷宫行为学实验检测大鼠学习记忆功能，运用膜片钳技术在脑片水平(1)模型组大鼠寻找平台潜伏期较对照组显著延长(P<0.05)，检测海马的突出可塑性。结果：在目标象限的停留时间较对照组明显缩短(P<0.05)，人参皂甙Rb1治疗后，大鼠寻找平台潜伏期较模型组缩短(P<0.05)，在目标象限的停留时间较模型组延长(P<0.05)；(2)在高频强直刺激（HFS）作用下，各组均有长时程增强（LTP）现象，但模型组LTP较对照组明显减弱（P<0.05），人参皂甙Rb1治疗后LTP明显增强（P<0.05）。结论：人参皂甙Rbl减轻了慢性缺氧大鼠在水迷宫实验中的行为学改变，并增强了慢性缺氧大鼠海马LTP，证实人参皂甙Rbl可明显减轻大鼠慢性缺氧性认知功能障碍，该作用与其减轻海马LTP抑制有关，为高原缺氧性认知功能障碍的防治提供了新思路，但其具体机制尚有待于进一步研究，本室将在此基础上进一步深入研究人参皂甙Rbl改善慢性缺氧性认知功能障碍的机制。 关键词：慢性缺氧；人参皂甙Rb1；认知功能障碍Q95-3，R742.1中图分类号： A文章编号：1673-627322-4242-04文献标识码：（2013） GinsenosideRb1AttenuatesChronicHypobaricHypoxia-Induced CognitiveDeficits* LIUHui-lin,LIUTao,XUXiao-na,WANGBing-shui,WANGFeng△ (DepartmentofNutritionandfoodhygiene,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an,Shaanxi,710032,China) ABSTRACTObjective:Atpresent,nospecificdrugexiststoprevent,delay,orcureChronicHypobaricHypoxia-InducedCognitiveDeficits.InordertoprovideanewwindowintotheChronicHypobaricHypoxia-InducedCognitiveDeficits,thepresentstudywasdesignedtoinvestigatetheeffectsofGinsenosideRb1oncognitivedeficitsinducedbychronichypobarichypoxia.Methods:ThirtymaleSDrats(200-250g)wererandomlydividedintothreegroupswith10ratsineachgroup:Controlgroup,ModelgroupandGinsenosideRb1therapygroup.Cognitivefunctionwasdetectedbythewatermazetask.HippocampalLTPatbrainsliceswasmeasuredbyelectrophysiologymethod.Results:Chronichypobarichypoxiacancauseseverecognitivedeficits,andGinsenosideRb1couldimprovethecognitivedeficitsinducedbychronichypobarichypoxia.LTPinhibitioninhippocampuscausedbychronichypobarichypoxiaweremarkedlyattenuatedbyadministrationofGinsenosideRb1.Conclusion:GinsenosideRb1exhibitstherapeuticpotentialforcognitivedeficitsinducedbychronichypobarichypoxia.OneofthemostimportantmechanismsispossiblythatGinsenosideRb1canprotectLTPinhippocampus. Keys:Hypobarichypoxia;GinsenosideRb1;CognitivedeficitsChineseLibraryClassification(CLC):Q95-3,R742.1Documentcode:AArticleID:1673-6273(2013)22-4242-04 前言 人类在高海拔地区的活动越来越频随着现代科技的进步， 繁，高原缺氧的生物学效应及其防治措施逐渐成为了广大科研工作者的研究热点。目前已明确，高原慢性缺氧对人体神经系统、循环系统、造血系统等各大系统均有显著影响，可诱发机体暂时甚至永久性的病理改变，引起多种疾病。众所周知，大脑以全身2%的体积消耗了全身20%氧气，故中枢神经系统对缺氧 *基金项目：国家自然科学基金项目（81102631） 最敏感，是慢性缺氧损害的主要靶器官之一。人体在高原慢性缺氧环境下可出现一过性甚至不可逆的记忆力减退、反应迟缓等，对此，目前尚无特效的防治措施[1]。多年来，广大科研工作者一直致力于寻找一种安全而有效的防治措施或药物。人参皂甙是人参中的主要生物活性物质，在人参的众多皂甙成分中以Rbl含量高，活性强，具有抗氧化、抗凋亡等重要的生理作用[2]。前人的研究结果提示人参皂甙可减轻颞叶癫痫所致的大鼠认知功能障[3]，但人参皂甙对慢性缺氧所致的认知功能障碍是否 (029)作者简介：刘慧琳(1978-)，女，硕士研究生，主治医师，主要从事认知功能障碍的临床与基础研究，电话：84775439，E-mail：lhlshd@163.com △通讯作者：E-mail：wfshids@163.com，(029)84775121王枫，电话：2012-12-22接受日期：2013-01-17（收稿日期：） 现代生物医学进展www.shengwuyixue.comProgressinModernBiomedicineVol.13NO.22AUG.2013 ·4243· 有治疗作用尚不明确。故本实验拟利用我校自行开发的低压氧仓模拟高原环境，复制大鼠慢性缺氧性认知功能障碍模型，运用行为学及膜片钳技术研究人参皂甙Rbl对大鼠慢性缺氧性认知功能障碍是否有治疗作用。 (mmol/L)：glucose(11)，NaCl(126)，CaCl2(2.4)，MgCl2(1.2)，NaH2PO4(1.2)，KCl(2.5)，NaHCO3(26)(用NaOH滴定pH至7.35-7.45)。持续供氧并冰浴条件下，利用震动切片机将鼠脑切为厚度400μm的脑片，取海马位置佳的脑片置于预充氧气、二34℃恒温条件下孵育1h，氧化碳混合气的人工脑脊液中，以恢复脑片活性。孵育后，小心将脑片移至浴槽，浴槽中持续灌流氧饱和的人工脑脊液（2ml/min），以维持脑片活性。1.6海马CA1区长时程增强(LTP)记录 记录电极内液为NaCl溶液（3mol/L），外液为人工脑脊液。测试脉冲参数：波形为方波，频率0.05Hz，波宽100μs，刺激强度以能诱发50%最大兴奋性突出后电位（fEPSP）为准。高频强直刺激（HFS）参数为：强度、波宽同测试脉冲，频率100Hz，时程1s。记录位点：利用倒置显微镜，将电极间距约300μm的激电极置于海马Schaffer侧支纤维处，将记录用玻璃微电极置于海马CA1锥体细胞层。测试步骤：给予适当强度的测试脉冲，开始记录fEPSP，待记录基线平稳后，继续记录fEPSP30min以上，给予间隔20s的两次HFS刺激，然后继续给予测试脉冲并记录fEPSP，持续1h以上。将刺激后的fEPSP斜率化为刺激前fEPSP斜率的百分比，该数值可作为评价fEPSP强度的定量客观指标。1.7统计学处理 实验所得数据结果以±s表示，用SPSS13.0进行统计学fEPSP斜率和寻找平台潜伏期的组间比较采用重复测量分析， 的多因素方差分析及Tukey-Kramer检验，大鼠在目标象限的停留时间用单因素方差分析进行统计学分析。以P<0.05为有统计学意义。 1材料方法 1.1材料及仪器 Ax-人参皂甙Rbl（购自西安宝信公司，纯度＞95.0％），opatch-700B放大器(MolecularDevicesCorporation，美国)，红Master-8脉冲发生器(A.M.P.I，外相差显微镜（Olympus，日本），1440A模数数模转换器(MolecularDevicesCorpora-以色列)， tion，美国)，其余试剂为国产分析纯。1.2实验动物及分组 雄性健康SD大鼠(来自解放军第四军医大学医学实验动物中心)30只，体质量200～250g，将动物随机分为三组。对照组(Controlgroup)，每日进缺氧舱饲养8小时，但不降气压，每日腹腔注射等量生理盐水；模型组(Modelgroup)，按计划每日缺氧8小时，每日腹腔注射等量生理盐水；人参皂甙Rbl治疗组(GinsenosideRb1group)，按计划每日缺氧8小时，从第一次2mg/kgd，1缺氧前开始给药，给予人参皂甙Rbl，腹腔注射，·次/日。缺氧28天后，先进行Morris水迷宫行为训练及测试，然后麻醉后断头处死并取海马组织，进行电生理记录。1.3大鼠慢性缺氧性认知功能障碍模型的复制 参照文献，利用我校自行设计的缺氧舱复制大鼠慢性缺氧性认知功能障碍模型[4]。内径45cm，可通过舱缺氧舱长80cm，门的玻璃窗了解舱内动物活动情况。舱顶有进气、出气口及压力表，其中进气口装有可调节大小的进气阀，出气口与真空泵相连，舱内置可吸收二氧化碳的钠石灰。置鼠笼于低压氧舱中，封闭舱门，开启真空泵，通过调节进气阀大小，使气压缓慢下降，气压降至380mmHg后，维持此压力8小时，然后缓慢调大进气阀，降低负压，直至常压。1.4Morris水迷宫行为测试 参照闫志强等人文献，稍做调整 6][5， 2实验结果 2.1人参皂甙Rb1可显著减轻慢性缺氧对大鼠寻找平台潜伏期的影响 在Morris水迷宫实验中模型组大鼠寻找平台的潜伏期明显长于健康对照组，有显著统计学差异(P<0.05)，人参皂甙 。缺氧28天后进行Rb1治疗后大鼠寻找平台潜伏期较模型组显著缩短(P<0.05)(Fig.1)，提示人参皂甙Rb1可显著减轻慢性缺氧导致的大鼠寻找平台潜伏期延长，减轻慢性缺氧对大鼠记忆力的损害。2.2人参皂甙Rb1可明显延长慢性缺氧大鼠在目标象限的停留时间 如图2所示，空间探索试验中，模型组大鼠在目标象限的停留时间显著短于对照组(P<0.05)，人参皂甙Rb1治疗组大鼠在目标象限的停留时间较模型组明显延长(P<0.05)，人参皂甙Rb1可显著延长慢性缺氧大鼠在目标象限的停留时间，再次证实人参皂甙Rb1可减轻慢性缺氧对大鼠记忆力的损害。2.3人参皂甙Rb1可显著减轻慢性缺氧导致的大鼠海马LTP抑制 电生理实验证实，给予HFS后各组大鼠海马fEPSP均较前增强，即各组均可诱发LTP，并持续1小时以上。与对照组相比HFS刺激后模型组LTP被显著抑制（P<0.05），人参皂甙Rb1治疗可显著减轻慢性缺氧导致的大鼠海马LTP抑制，人参皂甙Rb1治疗组LTP较模型组显著增强（P<0.05），从脑片电生理水平再次证实人参皂甙Rb1可减轻慢性缺氧对大鼠记忆 Morris水迷宫训练，共5天，每天训练2次，具体训练方法为：分别从4个不同象限的中点将大鼠头朝池壁放入水池，任其在水中自由游泳，如大鼠在60s内找到并爬上平台，让其在平台上停留30s，以强化记忆效果，逃避潜伏期为实际寻找平台所用的时间，如在60s内大鼠未能找到平台，则由实验者用工具将其引导至平台，同样让大鼠在平台上停留30s，以强化记忆效果，同时以60s为逃避潜伏期。上述运动轨迹被设在水池正上方的摄像记录系统实时记录。取每天训练所记逃避潜伏期的平均值作为当日的逃避潜伏期。②空间探索试验：在开始训练前和训练5天结束后进行实验，具体方法为：撤除平台，从原平台所在象限对侧象限的中点面朝池壁放入大鼠，任其在水中自由游泳120s，用设在水池正上方的摄像记录系统实时记录大鼠运动轨迹，并计算大鼠在平台所在象限活动的时间。1.5海马脑片制备 异氟烷吸入麻醉后断头处死大鼠，低温条件下快速取脑，然后将其浸入冰浴人工脑脊液中，该脑脊液已被预充氧气、二CO25%）氧化碳混合气（O295%、达饱和状态，其主要成份为 ·4244· 现代生物医学进展www.shengwuyixue.comProgressinModernBiomedicineVol.13NO.22AUG.2013 3讨论 高原慢性缺氧导致的认知功能障碍等生物学效应严重限制了人类在高原地区的活动，已成为了人类开发、利用高原的一大障碍，目前尚无一种安全而有效的防治高原缺氧性认知功能障碍的药物。本课题组长期致力于寻找防治高原缺氧性认知功能障碍的新药，在这方面积累了一定经验。人参是驰名中外的名贵中药材，在临床应用已有近千年历史，人参及其有效成分具有广泛的生物活性和医疗用途。近年来，人参的药理学研究进人了分子水平，因而人参的许多新的药理作用及其机制也逐渐被阐明。人参皂甙是人参中的主要生物活性物质，其中Rbl 图1人参皂甙Rb1对慢性缺氧大鼠寻找平台潜伏期的影响Fig.1EffectsofGinsenosideRb1onescapelatenciescausedbychronic hypobarichypoxia Note:*P＜0.05Modelgroupcomparedwithcontrolgroup；#P＜0.05 GinsenosideRb1groupcomparedwithmodel group. 含量最高，活性最强，具有重要的生理功能[2]。张明磊等人证实人参皂甙可显著减轻颞叶癫痫所致的大鼠认知功能障碍[3]。江山等人证实，人参皂甙可显著减轻大鼠海马脑片的缺血损伤[7]。上述结果均提示人参皂甙可能有改善动物认知功能的作用，但人参皂甙对慢性缺氧所致的认知功能障碍是否有治疗作用尚不明确。 水迷宫实验是由科学家Morris于1881发明的客观评价大鼠学习记忆的方法[8]，该方法问世后，很快的到了全世界相关领域科学工作者的一致认可，并被不断改进、完善，目前已成为研 10]究学习记忆的最佳行为学方法之一[9，。突触前纤维受到高频 刺激后相当长一段时间内，突触的传递效率和强度会成倍增加，这种高频刺激后突触传递效率增强的现象被称为LTP，是反映突触可塑性的客观指标，以海马最容易引出LTP[11]。目前已明确，海马损伤会严重影响动物和人的学习记忆功能 [12，13] ， 缺氧引起的认知功能障碍也和海马损伤密切相关[14]。海马LTP与大脑的信息存储能力密切相关，具有三大特征--特异性、时 图2人参皂甙Rb1对慢性缺氧大鼠在目标象限停留时间的影响Fig.2EffectsofGinsenosideRb1ontimeintheprobequadrantcausedby chronichypobarichypoxia Note:*P＜0.05Modelgroupcomparedwithcontrolgroup;#P＜0.05 GinsenosideRb1groupcomparedwithmodelgroup. 程长、可加性，可客观反映海马的突触可塑性，已成为在电生理 16]水平研究学习、记忆的金标准[15，。本实验利用我校自行设计、 制造的低压氧仓复制慢性缺氧所致的大鼠认知功能障碍模型，运用水迷宫行为学实验及膜片钳技术从动物行为学及脑片电生理两个不同水平证实人参皂甙Rbl对大鼠慢性缺氧性认知功能障碍的治疗作用。 本实验中，水迷宫行为学实验证实慢性缺氧可导致大鼠寻找平台潜伏期延长，空间探索试验证实缺氧可导致大鼠在目标象限的停留时间缩短，提示慢性缺氧大鼠学习记忆能力较正常大鼠显著下降，与前人研究结果一致[17-19]，缺氧对大鼠学习记忆功能的影响可被人参皂甙Rbl显著抑制，从行为学水平证实了人参皂甙Rbl对大鼠慢性缺氧性认知功能障碍的治疗作用。我们利用膜片钳技术从脑片水平验证了海马LTP可被慢性缺氧显著抑制，即慢性缺氧损害了海马的突触可塑性，给予人参皂甙Rbl治疗可显著减轻慢性缺氧对大鼠海马LTP的抑制，保护其突触可塑性，从脑片电生理水平证实人参皂甙Rbl对大鼠慢性缺氧性认知功能障碍的治疗作用。 综上所述，本实验中，人参皂甙Rbl减轻了慢性缺氧大鼠在水迷宫实验中的行为学改变，并增强了慢性缺氧大鼠海马LTP，证实人参皂甙Rbl可明显减轻大鼠慢性缺氧性认知功能障碍，该作用与其减轻海马LTP抑制有关，为高原缺氧性认知功能障碍的防治提供了新思路，但其具体机制尚有待于进一步研究，本室将在此基础上进一步深入研究人参皂甙Rbl改善慢 图3人参皂甙Rb1对慢性缺氧大鼠海马LTP的影响 Fig.3EffectsofGinsenosideRb1onHippocampalLTPinhibitioninduced bychroniccerebralhypoperfusioninrats Note:*P＜0.05Modelgroupcomparedwithcontrolgroup；#P＜0.05 GinsenosideRb1groupcomparedwithmodelgroup. 力的损害。 现代生物医学进展www.shengwuyixue.comProgressinModernBiomedicineVol.13NO.22AUG.2013 ·4245· 性缺氧性认知功能障碍的机制。 参考文献(References) [1]WangJ,KeT,ZhangX,eta1.Effectsofacetazolamideoncognitive 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