海藻酸钙凝胶固定葡萄糖氧化酶的研究

圈 海藻酸钙凝胶固定葡 2008，VoJ．25 No．2亿 爹与 生物 互程 Chemistry & Bioengineering 萄糖氧化酶的研究 肖志方 ，伍 林，易德莲 ，秦晓蓉 ，杨春琪 (武汉科技 大学化学工程与技 术学院，湖北 武汉 430081) 摘 要：利用海藻酸钙凝胶颗粒固定葡萄糖氧化酶(GOD)。确定了固定化务件，并考察了温度、pH值、储存时间对 固定化酶和游 离酶酶 活力的影响 ，测定了酶 活回收 率。确定 的固定化较优 条件为 ：CaCIz 5．0 (质量体积 比)，海藻酸钠 3．0％(质量体积比)；固定化酶的最适催化 温度 为 3l℃、最适 pH值 为 6．3，较 游 离酶分 别提 高 7℃和 0．6；固定化酶 的平 均酶活回收率为 61．69 。此 外，酶的储存稳 定性 能也有 所提 高，可重复 多次使 用。 关键词 ：固定化酶 ；葡萄糖氧化酶；海藻酸钙 ；凝胶颗粒 中图分类号 ：Q 814．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1672—5425(2008)02—0042—03 酶作为生物催化剂被广泛应用于化学工业 、制药 工业以及食品工业。由于酶的价格昂贵，人们希望酶 能被重复使用并保持活性，这促使酶的固定化成为人 们研究的热点。酶的固定化方法主要有吸附法、包埋 法 、共价耦联法和交联法等口 ]。其中，包埋法具有实 验条件温和、对生物活性单元失活作用小、不易泄漏及 可固定高浓度的生物活性单元等优点口]，是迄今应用 最为普遍的固定化技术。 葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)是一种能 特异性地催化 葡萄糖与氧气反应生成过氧化氢和 葡萄糖酸的黄素蛋白酶，在食品保鲜、环境监测中应 用广泛。作者在此利用海藻酸钙凝胶对葡萄糖氧化酶 进行了固定，并研究 了固定化条件和固定化酶的特性 。 1 实验 1．1 材料、试剂和仪器 葡萄糖氧化酶(活力>150 U·mg_。，于一20℃冰 箱内储存)，Sigma公司；海藻酸钠，粘度 (1％水溶液 ， 20℃)≥0．02 Pa·S，上海试剂站分装 厂(国产分装 )； 葡萄糖([口]。一+52．5。)，湘中地质实验研究所；其 它试剂均为国产分析纯，实验用双蒸水。 HZ200LB型恒温摇床，武汉瑞华仪器设备有限责 任公 司；DELTA320型酸度 仪，梅特 勒一托 利 多仪器 (上海)有限公司；wH一2微型旋涡混合仪，上海沪西分 析仪器厂；000922型 自动制冰机，Grant公司(中国制 造)。 1．2 固定化酶凝胶颗粒的制备 采用手工方法制备固定化酶凝胶颗粒(图 1)。将 待固定的酶液与阴离子溶液混合均匀，然后用此混合 液滴制成包埋酶的凝胶颗粒。滴定的总时间控制在形 成颗粒时问的 1％以内，以保证所有的颗粒基本上是 在同一时间形成。胶凝 60 min，随后用真空泵抽滤即 得到包埋酶的凝胶颗粒。将其放人 4℃冰箱中保存备 用 。 海藻酸钠阴离子溶液 氯化钙阳离子溶液 图 1 手工制备凝胶颗粒 示意图 Fig．1 Schematic diagram of hand-made preparation equipment for the capsule 1．3 凝胶化条件的确定 用不同浓度的海藻酸钠和 CaC1 溶液制成的固定 化酶 ，酶的固定化得率、扩散损失率等有 着较大 的差 异_4]。分别以海藻酸钠的浓度(质量体积比，下同)和 CaC1 溶液的浓度 (质量 体积 比，下 同)为 唯一变动因 素 ，选出较优的阴、阳离子溶液浓度，即得 出较优 的固 定化条件，从而可制得强度好、气泡量少 、形状 圆整的 基金项 目：湖北省科技厅博士后基金资助项 目(2003ABA075) 收稿日期：2007—1O～3O 作者简介 ：肖志方(1985一 )，男，湖 北成 宁人 ，硕 士研 究生，研 究方向 ：生物化 工及 生物应用 ；通讯联 系人 ：伍林 ，教授 ，博 士生导师，研 究方向 ：生物化工及生物应用、有机合成与功能高分子材料 。E-mail：wulin65@163．COrn。 维普资讯 http://www.cqvip.com 肖志方等 ：海藻酸钙凝胶 固定葡萄糖 氧化酶 的研 究／2oo8年第 2期 凝胶颗粒 。 1．4 GOD活力的测定 酶活力测定采用滴定法[5 ]。 1．5 固定化酶酶活回收率的测定 分别测定游离酶和固定化酶在各自最适催化条件 (温度、pH值)下的活力，然后按下式计算固定化酶酶活 回收率。 固定化酶酶活 回收率一 X100 2 结果与讨论 2．1 凝胶化条件的确定 分别改变海藻酸钠溶液和 CaC1 溶液的浓度，考 察其对凝胶颗粒 的影响，结果见表 1、表 2。 表 1 海藻酸钠浓度对凝胶颗粒 的影 响 Tab．1 The effect of sodium alginate concentration on the forming process of Ca-alginate capsule 注；CaC12溶液浓度始终保持6．0％，温度为 24~C 表 2 CaC! 浓度对凝胶颗粒的影响 Tab．2 The effect of CaC12 c0ncentrati0n on the forming proc ess of Ca-alginate capsule 注 ；海藻酸钠溶液浓度始终保持 3．0 ，温度 为 24℃ 从表 1可 以看出，确定 CaC1。浓度后，随海藻酸钠 浓度的增 加 ，胶 粒 的下 沉时 间缩 短 ，且 胶 膜厚 度 减 小l7]。当阴离子溶液浓度过大时 ，形成的胶粒 圆整度 不好，许多颗粒呈现出蝌蚪状或丝状 ，并且凝胶颗粒中 含有较多的气泡，难以去除。因此，确定海藻酸钠的浓 度为 3．0％。 从表 2可以看出，确定海藻酸钠浓度后 ，随 CaC1 浓度的增加，下沉时问延长，且胶膜厚度增加l7]。考虑 到 CaC1 浓度过高会对生物活性酶产 生不利影 响，因 此，确定 CaC1 浓度为 5．0 。 2．2 固定酶的凝胶颗粒的制备 国 将溶解酶液 1 mL加入到 3O mL 3．0 海藻酸钠 溶液中，在旋涡混合仪上混匀；然后将混合液逐滴滴人 5．0 CaC1 溶液中，即可形成包埋有 GOD的凝胶颗 粒(直径约 2～4 mm)，见图 2。 图 2 包埋有 GOD的海 藻酸钙凝胶颗粒 Fig．2 Photos of GOD-immobilized Ca-alginate capsules 2．3 温度对游离酶和固定化酶酶活的影响 利用恒温摇床振荡并依次控制反应温度为 2O℃、 24℃ 、28℃ 、32℃、36℃、4O℃ ，分别测定游离酶和固定 化酶的活力 ，结果见图 3。 温度／'C 图 3 温度对游离酶和 固定化酶酶活 的影 响 Fig．3 The effects of temperature on enzyme activity of free GOD and immobilized GO D 从图 3可以看出，游离酶的最适反应温度为 24℃ 左右 ，而固定化酶的最适反应温度为 31℃左右 ，升高 了 7℃。从而可知固定化酶能更好地适应较 高的反应 温度条件。 2．4 pH值对游离酶和 固定化酶酶活的影响 先配制一系列不同 pH值的 1／15 mol·L 的磷 酸氢二钠一磷酸二氢钾缓 冲溶液，然后用这一系列不 同 pH值 的磷酸缓冲溶液配制得到浓度为 20 g·L 的一系列不同 pH 值 的 【)_葡萄糖溶液。再分别对游 离酶、固定化酶进行酶活测定，反应温度为 24℃。图 4 是 pH值对游离酶与固定化酶的酶活力影响曲线 。 从图 4可以看出，游离酶催化的最适 pH 值约 为 5．7，而固定化酶的最适 pH 值约 为 6．3，相 比提高 了 约 0．6。说明酶固定化后 ，催化性质发生了一 定程度 的改变。 维普资讯 http://www.cqvip.com 盈 图 4 磷酸缓冲溶液 pH值对酶活的影响 Fig．4 The effects of pH value of phosphate buffer solution on enzyme activity of free GOD and immobilized GOD 2．5 储存时间对游离酶和固定化酶酶活的影响 将一定量 的游离酶和固定化酶 (颗粒 )放人 37℃ 的恒温摇床中，每天测定酶活 ，结果见图 5。 储存时间／d 图 5 储存时间对游离酶 和固定化酶酶活的影响 Fig．5 The effects of storage time on enzyme activity of free GOD and immobilized G0D 从图 5可以看出，固定化酶的活力下降速度 比游 离酶要慢，37℃下储存 5 d后 ，游离酶活力下降至 50 左右 ，而固定化酶仍有超 过 80 的活力 。因此，固定 化过程使酶 的储 存稳 定性得 到了一定程 度的改 善。 37℃储存 1 d酶活力变化相当于4℃下储存 45 d酶活 力的变化_8]。 2．6 固定化酶的酶活回收率测定 取游离酶，于 24℃、pH值为 5．7的条件下测定酶 的活力 ；取固定化酶，于 31 oC、pH 值为 6．3的条件下 测定酶的活力；根据公式，计算固定化酶的酶活回收 率 。结果见表 3。 表 3 固定化酶的酶活回收率 Tab．3 The recovery rate of immobilized GOD activity 肖志方等：海藻酸钙凝胶固定葡萄糖氧化酶的研究／2OO8年囊 2翻 由表 3计算得 出固定化酶 的平均 酶活回收率 为 61．69 。 2．7 固定化酶使用次数对酶活力的影响 取 50颗包埋酶的凝胶颗粒 ，于 pH值 6．3、31℃的 条件下测定酶活力 。测完后分离出凝胶颗粒，再次测 定酶活 ，如此重复多次 ，记录每次的酶活力变化 ，结果 见图 6。 图 6 使 用次数对 固定化酶 活力的影 响 Fig．6 The effect of reused times on enzym e activity of immobilized G0D 从 图 6可以看出，重复使用 7次后 ，固定化 GOD 仍保留 60 左 右 酶 活 (以第 1次测 定 时 的 活 力为 100 )，可见 GOD固定化以后 ，可以重复使用。而游 离 GOD与底物作用 1次后 ，就不可使用 了。 3 结论 用海藻酸钙凝胶颗粒包埋葡萄糖氧化酶(G0D)， 操作简便易行 ，反应条件温和。通过对胶凝条件的研 究和对游离酶及固定化酶 的活力研究 ，确定出较优的 固定化条件为 ：海藻酸钠 3．0 ，CaC1 5．0 ，凝胶化 时间 1 h；游离酶的最适催化条件为 24℃、pH值 5．7， 而固定化酶的最适催化条件为 31℃、pH值 6．3，相比 分别提高了7℃和0．6；固定化酶的平均酶活回收率为 61．69 。此外 ，固定化酶的储存稳定性也有所提高 ， 且可重复使用。 参考文献 ： [1] 张伟，杨秀山．酶的固定化技术[J]．自然杂志，2000，22(5)：282— 286． [2] 刘春叶，王亚明，唐辉．酶的固定化及化学修饰[J]．云南化工， 2002，29(5)：29—31． I-3] 董绍俊，车广礼，谢远武．化学修饰电极[M]．北京：科学出版社， 1995：95-97． [4] Blandino A，Macas M，Cantero D．Glucose oxidase release from calcium alginate gel capsules[J]．Enzyme and Microbial Technolo— gY，2000，27(3)：319 324． Is] 孙君社，汪正强，刘萍．酶与酶工程及其应用[M]．北京：化学工业 出版社，2006：281—282． (下转第 53页) 解 蜒蹴 维普资讯 http://www.cqvip.com 戢 峻等：L一丝氨酸甲酯盐酸盐的合成工艺研究／2008年囊 2啊 红外光谱，b谱线为使用甲醇一乙醚一石油醚体系重 结晶得到 C H。NO。·HC1的红外光谱 ，c谱线为未经 重结晶得到 C H。NO。·HC1的红外光谱 。1740 cm 的吸收峰为酯羰基的伸缩振动峰，证 明 丝氨酸酯化 成功。3300~3500 cm 的吸收峰均存在，其中 a与 b 基本吻合 ，与 c的峰位和峰强略有差异 ，说明经过重结 晶，产品纯度得到了提高 。 3 结论 采用氯化亚砜法合成 了 丝氨酸 甲酯盐酸盐 ，得 到最佳合成工艺条件为：将 100 mL无水 甲醇与 20 mL氯化亚砜在一IO~C下反应 1．5 h(其中滴加氯化亚 砜 30 min，保温反应 1 h)。再 与 9．0 g L-丝氨 酸在 38℃反应 7 h。终 止反 应，加 入 20 mL无水 甲醇 于 国 40℃进行抽滤，最后加入 100 mL无水 乙醚与 20 mL 石油醚的混合液结 晶及重结 晶。在此条件下，L一丝氨 酸 甲酯 盐 酸 盐 的产 率 为 82．4 ，熔 点 为 157．8～ 158．6℃，旋光度为 4．42。(c===2，Methano1)。 参考文献 ： [1] 袁牧，钟裕国，庞其敏，等． 氨基丁酸衍生物的合成及抗惊厥活 性[J]．中国药学杂志，1999，34(2)：124 126． E2] 彭珍荣，刘爱福，唐兵．氨基酸生产和海洋生物的氨基酸资源开发 EJ]．氨基酸和生物资源，1998，20(4)：55—58． [3] Madhavan Nampoothiri，Ashok Pandev．Genetic tuning of coryne— form bacteria for the 0verpr0ducti0n of amino acids[J]．Process Biochemistry，1998，33(2)：147—161． E4] Brenner M ，Huber W．Preparation of a—amino acid esters by al— coholysis of the methylesters[J]．Helv Chim Acta，1953，36： 1109—1114． Study on Synthesis of L-Serine M ethyl HydrOchlOride ji Jun，LU Er-bei，W AN Wen-ting，LI Ming，LEI Hao，DING Yi—gang，XIONG Jia-lin (Key Lab for Green Chemical Process of Ministry of Education．School of Chemical Engineering& Pharmacy ，Wuhan Institute o厂Technology，Wuhan 430074 ，China) Abstract：L-Serine methyl hydrochloride was synthesized by esterifying process，with anhydrous methanol， thionyl chloride and L-serine as raw materials．To obtain the highest yield of L-serine methyl hydrochloride， the effects of different operation condition on yield of the product were investigated．On the basis of guarantee— ing the purity industrially required，the recrystallization program was improved． Keywords：L-serine methyl hydrochloride；synthesis；recrystallization (上接第 44页) E6] Yang Y M，Wang J W，Tan R x．Immobilization of glucose oxidase dase within calcium alginate gel capsules[J]．Process Biochemis— on chitosan—SiO2 gelEJ]．Enzyme andMicrobialTechnology，2004， try，2001，36(7)；601—606． 34(2)：126—131． E8] 黄健，邓丽娟，严兵．一种乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫 E7] Blandino A，Macas M，Cantero D．Immobilization of glucose oxi一 诊断试剂盒及应用EP]．CN 1 908 666，2007—02—07． Study on Immobilization of Glucose Oxidase by Calcium Alginate Gel Capsules XIAO Zhi—fang，WU Lin，YI De-lian，QIN Xiao-rong，YANG Chun qi (College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，W uhan 430081，China) Abstract：In this study，calcium alginate gel capsule was chosen as the carrier to immobilize glucose oxidase (GOD)．The optimal conditions for G0D encapsulation were obtained as CaC12 5．0 (ratio of mass to volume) and sodium alginate 3．0 (ratio of mass to volume)，and the effects of temperature，pH value，storage time on the activity of free and immobilized GOD were studied．Furthermore，the recovery rate of immobilized GOD activity was investigated．The results showed that the optimum pH value and temperature for immobilization GOD were 6．3 and 31℃ 。respectively，which enhanced 0．6 and 7℃ compared to that of free enzyme．And the average recovery rate of immobilized GOD activity was 61．69 ．Moreover，immobilized enzyme had good stor— age stability and could be used repetitiously． Keywords：immobilized enzyme；glucose oxidase；calcium alginate；gel capsule 维普资讯 http://www.cqvip.com